实验4淡水绿藻分离纯化与种群增长影响因素分析..docVIP

实验 淡水绿藻分离纯化与种群增长影响因素分析 一、实验目的 1.1了解常用的藻类培养基配方、适用性及其配置方法。 1.2 掌握常用的藻类分离纯化技术，熟悉藻类的培养设施。 1.3 测试光照、温度、盐分、pH值等不同生态因子对藻类种群增长速率的影响。 二、实验原理 2.1纯培养 藻类培养首先要有藻种。从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离来，而获纯种培养。真正的“纯种培养”是指在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。这是进行科学研究不可缺少的技术，而在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。 用作预备培养的培养液，各种藻类是不同的，对一些难以培养的藻类一般加入土壤抽出液较好。预备培养液营养成分浓度应小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水样中藻类种类较多，就应使用几种不同的培养液，使藻类在适合于自己繁殖的培养液中繁殖起来。可用三角烧瓶或试管作培养容器，加入容量1/4～1/3培养液。然后把经筛绢过滤除去大型浮游生物的水样接种进去，放在合适温度下或室内靠北窗口下培养。 在培养附着藻类时，容器可静止不动；而培养浮游藻类时，应该每天摇动一次。有的藻类在普通培养液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困难。此时需改变培养液浓度，加入葡萄糖、蛋白胨等有机物，补充微量元素和辅助生长物质，加入土壤抽出液，就有可能获较好效果。 2.1 培养基藻类培养基的配方极多，每种配方主要适用于一定藻种，表1列举的是比较常用的几种。 水生4号和克诺普（Knop）培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。 2.2 培养基的配制原则 1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等；2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等；3）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH；4）要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）；5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅；6）要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。 2.3 基础培养基的配制方法 表1各种培养基的用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5％琼脂。 2.4 土壤抽出液制作方法 1）先在试管底部，加入高约1cm土壤（采用腐殖化的农田和庭院土）；2）再加入水使达5cm，塞上棉塞，采用蒸气间隙灭菌，每天灭菌1小时，连续二天（备注：由于气泡上升，棉塞可能弄脏，因此最好先在水中煮一段时间，使气泡跑掉后，再加棉塞进行灭菌）。 三、实验仪器药品 移液器 (200 ul， 1000 ul)，15 ml试管及配套试管塞，1.5ml EP管，9cm玻璃平皿，封口膜，保鲜袋，手套，口罩，超净工作台，显微镜，温度计，电导率仪，pH计，光强测试仪，光照培养箱，表1所列全部试剂。 四、实验内容和步骤 4.1 培养基的配制 按表1配制水生4号培养液，调节pH值至7.5（左右）。固体培养基则在培养液内加入%琼脂。配好的培养基于高压灭菌锅内121℃灭菌20分钟，待用。液体培养基可分装入已灭菌的试管中；固体培养基待冷却至50℃后，在超净台中倒入预先灭过菌的玻璃平板中。 4.2 样品的采集与富集培养 采集湖泊或池塘中藻类的水样，置于干净的三角烧瓶中，放在合适温度下或室内靠北窗口下培养。在培养附着藻类时，容器可静止不动；而培养浮游藻类时，应该每天摇动一次。 4.3 藻类的分离培养 （1）稀释分离法 把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。在无菌条件下采用逐步稀释的方法， 边稀释，边在显微镜下镜检，直到镜检视野中每滴样品只含有2—3 个细胞时，即停止稀释，开始分接培养。具体过程如下： 1）取已灭菌的1.5 mlEP管数个，在第一个试管中加藻液样品1ml，其他EP管中加入一定体积的无菌富集培养液0.5ml； 2）从第一管中取藻液0.5ml 加到第二管中，充分振荡，使均匀稀释，此时藻液被稀释了2倍； 3）再用一支新的消毒刻度移液管，吸取第二管中的稀释藻液0.5ml 加入第三支试管中， 如前振荡，使均匀稀释，此时藻液被稀释了4 倍； 4）以后依次同样滴入第四管、第五管中，充分均匀稀释，当滴至第五管时，此时藻液被稀释了16 倍，镜检发现每滴稀释样品中只有2-3 个细胞， 可以用这样的藻液进行培养； 5）从稀释16 倍的藻液中各取0.2