实验一龙须菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因及18SrRNA基因的基因拷贝数确定及比较..docVIP

实验一 龙须菜(Gracialria lemaneiformis)中 半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因及18SrRNA基因的 基因拷贝数确定及比较 实验原理 基因组DNA用多种不同的限制性内切酶酶切，用GPU和18SrRNA基因探针杂交，若有多拷贝，则应有多个杂交带，若多数酶切结果显示单一条带则为单拷贝。 技术路线： 总DNA提取→酶切→基因探针杂交→显示 实验材料和试剂 实验试剂：红藻、CTAB缓冲液、酚/氯仿抽提液、10T/1E 10T/0.1E、3M醋酸钠溶液、变性液、中和液、转移液(20XSSC)、洗膜液I、洗膜液II、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液III、缓冲液IV、PVPP、巯基乙醇、蛋白酶K1.5ml、氯仿、异丙醇、RNaseA、无水乙醇、50XTAE、琼脂糖、Marker、载样缓冲液、限制性内切酶、ddH2O、硝酸纤维素膜、蒸馏水、玻璃棒、滤纸、杂交试剂盒、杂交塑料袋、kit 实验仪器：冰浴塑料盆、称量纸、剪刀、取液器、枪头、研钵、吸水纸、塑料离心管(10ml)、电泳仪、电泳槽、一次性手套、水漂、胶布、保鲜膜、记号笔、镊子、电炉、烤箱、摇床、封口机 实验步骤： 红藻总DNA的提取（2人/组） 称取2.5g藻，剪断（越细越好，但要注意时间，剪刀须消毒）后放入研钵中，加2g PVPP固体聚乙烯砒咯烷酮（可选），在液氮中用力充分且快速研磨，直至基本为白色的粉末（期间注意不要解冻，要不时添加液氮）。 立刻转移于10ml塑料离心管中，迅速加1~2 ml/g CTAB缓冲液（临用前加0.2% V/V β-巯基乙醇），在 60-65℃ 温浴30 min，期间不时颠倒混合，12000 rpm 离心 5min。 取上清液，加蛋白酶K至终浓度为100?g/ml (相当10?l-10mg/ml母液/ml上清)，50℃水浴3h，不时颠倒混合。 用等体积酚/氯仿（注意最上面覆盖了一层Tris，需取下层有机相）抽提（颠倒混合）10 min，12000 rpm 离心 5 min，取上清（尽量不要将下面的有机相取上，但也保证上清的体积），用等体积氯仿再抽提5 min，12000 rpm 离心 5min。 取上清液，加入 2/3 体积的异丙醇，颠倒混合，在 -20℃ 下沉淀 15 min，再于室温 12000 rpm 离心 15 min，祛除上清。注意DNA沉淀不要被倒掉！ 用1ml 70% 乙醇洗沉淀（去除盐分），然后12000 rpm 离心 15 min。祛除上清，空气干燥沉淀（大约15-20分钟）。此时纯的DNA为透明无色。 加200ml TE1（10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA）完全溶解DNA沉淀，37℃ 静置10 min。 取出稍加混匀，立即于12000 rpm 离心 5 min（严格按此操作，对最终多糖的驱除很重要）。在不干扰沉淀的情况下，把上清液移到新的1.5ml Eppendorf管中（不少于160ml），取6ml准备进行步骤2。 剩下的DNA溶液补充水至200ml，加入RNase至终浓度100mg/ml，37℃消化30 min。 用等体积酚/氯仿（取下层有机相）抽提（颠倒混合）10 min，12000 rpm 离心 5 min，取上清，再用等体积氯仿抽提5 min，12000 rpm 离心 5min。 取上清，加1/10体积3M醋酸钠和2倍总体积的-20℃无水乙醇，若有絮状沉淀生成或外观浑浊则立即12000 rpm 离心 15 min使DNA沉淀，若无沉淀则-20℃放置20min后12000 rpm 离心 15 min使DNA沉淀。 用 70% 的 -20℃ 乙醇洗涤沉淀DNA，12000 rpm 离心 15 min，祛除上清，空气干燥沉淀。把DNA溶在 30ml TE2（10 mM Tris，pH 8.0，0.1 mM EDTA），留3ml 龙须菜总DNA实验二用，3ml 点于膜上后，继续步骤4-1，余者进行步骤3。 取提取的龙须菜总DNA 6ml加1/6体积载样缓冲液做1%凝胶电泳检测，目测定量。分子量对照(marker)加5ml。 用3~4种（每组选择一种）限制性内切酶酶切 3~5mg/种。每酶切1mgDNA 采用20ml酶切体系,等量放大到对应的酶切体系（根据总DNA 电泳结果推测其DNA浓度，从而确定酶切时需要取的DNA的体积），具体酶切操作见说明书。酶切过夜，加2倍体积无水乙醇，混合，置于-20℃，沉淀、2小时以上，12000 rpm 离心 15 min使DNA沉淀，祛除上清，空气干燥沉淀。加40mlTE1溶解DNA（根据具体情况，若总DNA量较少，也可减少体积到20ml），加1/6体积载样缓冲液点样，梳齿合并（若20ml样品体积也可不合并，用原来的点样孔），于80v 1.0%琼脂糖