遗传实验14、15小鼠骨髓细胞染色体标本制备答题.pptVIP

一、实验原理 骨髓细胞 骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。 经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在预冷的载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。 二、实验目的 学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。 观察小鼠染色体的形态特征,统计细胞的染色体数目。 三、实验材料 小白鼠（2n=40） 四、实验器具和药品 1.器具：注射器（1ml，5ml各一支）、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。 2.药品： 0.15mg/ml 秋水仙素， 1%柠檬酸三钠，固定液（3份甲醇，1份冰乙酸，临用时现配），Giemsa染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液（PBS）pH6.8。 六、实验步骤 1、处理： 用1.5mg/kg体重剂量，腹腔注射秋水仙素处理小鼠。本次实验的注射量为0.1ml/10g体重，即用上述配制的秋水仙素溶液按每10g体重注射0.1ml（每只小鼠按30g体重计算，注射0.3ml，含秋水仙素0.045mg）。注射24小时后，可以取骨髓。 六、实验步骤 3. 低渗： 将细胞悬液在1000rpm/min离心5min，弃除上清液，留0.5ml摇匀。向细胞液中再加入1%的柠檬酸三钠溶液 5ml ，用吸管轻轻吹打均匀，在室温下低渗 30min。 低渗期间，配制固定液，即甲醇：冰醋酸为3:1 （v/v)，置 4℃冰箱中备用。 4. 预固定(第1次)： 低渗处理后的细胞悬液离心5分钟， 留1ml原液，摇匀。加入新配制的固定液至6ml， 吹打均匀，固定5分钟，再在1000rpm/min 离心3-5min，去掉上清液。 5. 固定（第2次）： 沿离心管壁慢慢加入新配制的固定液6ml， 用吸管轻轻吹打均匀，室温下固定5min， 1000rpm/min 3min，弃去上清；如此 反复固定两次（共固定3次）。 6.细胞悬液： 根据管底细胞量的多少，加入新配制 的固定液0.3~0.8ml，用吸管打均匀， 使其形成细胞悬液。 * 购买小鼠（体重30克最佳；尽量雌雄各半） 溶液配制： (1) 2.2%柠檬酸三钠：称11g柠檬酸三钠到500ml蒸馏水中，充分溶解； (2) 1%柠檬酸三钠： 取5g柠檬酸三钠溶解到500ml蒸馏水中，充分溶解； (3) PBS（pH6.8): A液：取Na2HPO4 12g溶于500ml蒸水中，充分溶解； B液：取KH2PO4 4.55g溶于500ml蒸水中，充分溶解； 使用时,A、B液等体积混合，即为pH6.8的PBS； (4) 0.15mg/ml 秋水仙素：取秋水仙素15mg溶于100ml 0.85%生理盐水 中，混匀； (5) 75%酒精： 取375ml 95%乙醇，加入125ml馏蒸水； 五、实验准备 2. 处死及收集骨髓细胞： （1）断颈法处死小鼠。剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出(注意股骨的完整性) ，擦净股骨上的肌肉。 （2）去股骨的髋面，将吸有2.2%柠檬酸三钠溶液的小注射器的针头插入，反复数次吹出骨髓细胞，反复吹打直至股骨呈白色(注意吹干净，充分收集骨髓细胞) ，制成细胞悬液。 六、实验步骤 六、实验步骤 7. 滴片： 将预冷的载玻片（0℃冰浴），水平或倾斜45°角放置，用吸管吸取细胞悬液，从约 0.5~1m高处滴 1~2滴到片子上，用口将其吹干，静置使其干燥。 8. 染色： 将干燥的玻片放入2ml吉姆萨原液加入40ml磷酸缓冲液（pH6.8）配成的染液中染色20min，用磷酸缓冲液（pH6.8）冲洗，晾干后镜检。 七、观察 低倍镜下寻找中期分裂相，然后用高倍镜和油镜观察染色体形态，统计染色体数目。 可见小鼠的40条染色体呈紫红色。 小鼠骨髓细胞的40条染色体 小鼠骨髓细胞染色体图 小鼠骨髓细胞染色体放大图(10×100)