第五章目的基因的获取分析.ppt

重组DNA基本技术原理（一）目的基因获得（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（DNA连接酶）（四）重组DNA导入受体菌（五）重组体的筛选 （六）克隆基因的表达 未知基因的获得途径： ⒈构建基因组文库利用鸟枪法克隆目的基因 2.构建cDNA文库，筛选目的基因 3.mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 4.酵母双杂交体内鉴定基因 本 章 内 容 第一节 基因组DNA的片断化第二节 基因的化学合成 第三节 目的基因的保存和扩增 第四节 目的基因的分离和扩增 第一节 基因组DNA的片断化 二、限制性内切酶消化法 一. 机械切割法 1. 优点 如果带有粘性末端，产物可以 直接与载体连接，连接效率高 ②消化的片断分子量太大或太小 第二节 基因的化学合成 1. 磷酸二酯法 （2）合成过程 2. 磷酸三酯法 固相磷酸三酯合成过程 二、 化学合成DNA片断的组装 （3）连接酶连成完整双链 2. 互补延伸连接法 三、 寡聚核苷酸化学合成的用途 第三节 目的基因的保存和扩增 文库：是指一种全体的集合。 通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。 克隆并不是为了保存，而是为了分离。 为什么要建基因文库？ 高等生物的基因组DNA十分复杂，单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知基因非常难的，必须构建基因文库，利用文库筛选技术获得该基因的阳性克隆，然后对其进行分析。 基因文库的分类 基因组文库：提取染色体基因组DNA。如果要研究的是控制基因表达的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列。 cDNA文库：mRNA反转录成的cDNA。如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸序列，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列推导出来。 2. 载体选用 （1）λ噬菌体载体 （2）黏粒载体 最早用于基因克隆的载体。 只能容纳比质粒分子量更小的片段。 不能用于核基因组文库。 适合于短序列的克隆文库。叶绿体DNA文库、线粒体DNA文库、cDNA文库。 3. 基因组文库构建的一般步骤 （3）载体与基因组DNA大片段的连接 4. 基因组文库的大小 5. 基因组文库的扩增及保存 三、 cDNA文库的构建 3. 构建cDNA文库的一般步骤 （2）mRNA的分离纯化 （3）cDNA的合成 ② 降解mRNA模板 ③ cDNA第二链合成 ④去掉发卡结构 妙用RNaseH（置换合成法） （4）cDNA与载体连接： 4. cDNA文库的大小 cDNA文库构建的实例 四、 酵母双杂交系统 一、酵母双杂交系统的作用 2. 拆开 Domain 3. 重组Domain （1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合 （2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合 双杂交原理 三、构建双杂交体系的宿主菌 五、构建双杂交体系的穿梭质粒 （1）BD-plasmid （2）AD-plasmid 六、酵母双杂交的实验过程 （1）存活选择 （2）蛋白结合选择 一、核酸杂交法 最常用，最可靠，适用于大量群体的筛选 把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜之后，用特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆。 关键因素：如何获得实用性的核酸探针 探针的来源 ①用其它生物已分离到相关基因的核酸序列作为探针 例子： 用非洲爪蟾的组蛋白基因探针分离到了海胆的同源性基因； 用非洲爪蟾的肌动蛋白基因探针分离到盘网柄菌的同源基因； 用水稻的psbA基因探针分离到了高梁的同源基因等等 自然界中一些蛋白质的核苷酸编码序列，在其进化的过程中保持着高度的保守性 ②根据蛋白质家族保守序列分离相关基因 同一个蛋白质家族内，存在着具有共同氨基酸序列的区段，即保守区。这些保守区往往是由彼此相邻的6～7个氨基酸组成，推导合成寡核苷酸探针库，用来分离编码相关蛋白质的cDNA。 如：分离编码蛋白质激酶的cDNA ③根据蛋白质的氨基酸序列人工合成寡核苷酸探针 没有现成的核酸探针时，怎么办？ a 探针的长度 通常使用17～20个核苷酸，保证杂交的特异性。 b 简并性 选择密码简并程度最低的氨基酸序列，合成多种寡核苷酸混合的序列进行检测。 二、差别杂交筛选法 适用于分离在特定组织中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、以及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节的基因，也可有效地用来分离经特殊处理而被诱发表达的基因。 属于核酸杂交的范畴