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微生物技术实验 产黑色素菌株的分离、选育和发酵 黑色素的分布及基本特征 黑色素广泛存在于生物界中的一类从红色，褐色到黑色的天然色素 Melanin 黑色素的类型及其合成途径 真黑色素：多巴途径 棕黑色素 ：酪氨酸氧化为多巴后，有半胱氨酸参与反应 异黑色素 ：植物和微生物 脓黑色素：尿黑酸途径 神经黑色素 ：脑中产生 酪氨酸酶的生化性质及生理功能 酪氨酸酶（EC 1.14.18.1），广泛存在于动物、植物及微生物中 特殊之处：同时具有两种不同的催化活性：以单酚物质如酪氨酸为底物的单酚氧化酶的活性，又称甲酚酶活性；以双酚物质如左旋多巴为底物的双酚氧化酶的活性，又称为儿茶酚氧化酶活性 酪氨酸酶的的结构 Vegetable fruit browning 酪氨酸酶的应用 1.合成左旋多巴和黑色素 :帕金森病 等； 2.食品工业方面——褐变：色泽 3.有机合成及化学修饰 4.应用于生物传感器 ：检测酚类等 实验步骤 Ⅰ 分离产黑色素的细菌 Ⅱ 诱变育种 Ⅲ 发酵生产黑色素 Ⅰ 分离产黑色素的细菌 在自然界中，土壤是微生物生活的大本营，是人类开发利用微生物资源的重要基地。 分离微生物的策略 分离微生物常用的方法： 稀释平板分离法和划线分离法 Ⅰ实验步骤： 1、 土样采集点的确定： 要求采集地具有代表性，能代表该地主要土壤类型和主要植被类型。 3、 菌的分离：称10g土样于水中，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20分钟，使土样与水充分混合，并使细胞分散。用一支1 ml无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推做10倍稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6稀释液0.1ml涂布平板。28℃培养3天。 4、 纯化：挑取产黑色素(包括红至褐色素)的单个菌落接种斜面，同时作涂片检查，若有不纯，应进一步挑取此菌落采用划线分离或制成菌悬液作稀释分离，直至获得纯培养。 5、 复筛：将纯化的菌种在筛选平板上划线，28℃培养2天。 6、 菌株性质鉴定 ⑴ 菌落特征 观察在筛选平板上产黑色素菌落的特征。 ⑵ 革兰氏染色显微镜观察 ⑶ 产黑色素的性质 观察挑选菌株所产黑色素的基本性质。 Ⅱ 诱变育种获得营养缺陷型（生物素）高产黑色素的菌株 实验原理 基因突变是微生物诱变育种的理论依据。 生物经理化因子的处理可以提高基因突变的频率，因此采用物理因素或化学因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，以提高突变频率和扩大遗传变异的幅度，然后从中筛选出所需要的突变菌株，这便是诱变育种。 其中在营养上表现出某种缺陷的变异菌株，叫做缺陷型菌株。它是遗传学研究和遗传育种工作中不可缺少的重要材料。 亚硝基胍（NG或NTG）是一种广泛使用的强诱变剂。它主要在DNA链的复制区引起G:C A:T转换，即使在杀菌率很低的情况下也能诱发高频率的突变。对于细菌的处理一般通过制作杀菌曲线，采用杀菌率在70%-90%的诱变剂量处理微生物为好。 Ⅱ 诱变育种 培养基 LB培养基（完全培养基）：蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml，pH7.0-7.2 基本培养基MM：(NH4)2SO4 1g，K2HPO4 7g，KH2PO4 3g，柠檬酸钠 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，葡萄糖 5g，蒸馏水 1000ml，pH自然（~7.0） Ⅱ 诱变育种实验步骤 1、制备菌悬液 ① 挑取少许斜面菌种接种于盛有5ml LB液体培养基的试管中，28℃振荡培养过夜。 ② 取0.5ml培养液转入另一盛有5ml LB液体培养基的试管中，28℃振荡培养6-7小时。 3、 涂平板 取0.1ml 上述菌液放到LB培养基平板上，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂满整个平板表面。 5、 涂布平板 ① 挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到装有4.5ml生理盐水的试管中，摇匀，制成处理后菌悬液。 ② 取上述菌悬液0.5ml于盛有4.5ml生理盐水的试管中，稀释到10-4。分别取10-1、10-2、10-3和10-4稀释液涂布LB平板，每个平板涂0.1ml，经诱变处理的稀释液每稀释度涂布3个平板，置28℃培养两天。 (凡是有亚硝基胍的器皿，都要置于通风处用1N NaOH溶液浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。注意不要让含有NG的上清液滴在皮肤或衣物上) 6、营养缺陷型的检出 ① 点种法 取基本培养基(MM)和完全培养基(LB)平板，作好成对与方向的标记(即一皿MM和一皿LB为一对)，将事先已编号的格