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手足口病RT-PCR检测标准操作程序_TianGen_1_2.
手足口病RT-PCR检测标准操作程序(200年月日第1版)
标准编号:检测项目: 检测方法: PCR PCR仪器: Bio-Rad iCycler
检测原理
’-UTR区基因序列及EV71、CA16的VP1-VP3基因序列,设计特异性引物(PE、EV71、CA16),通过Nested RT-PCR扩增基因片段,检测标本中是否存在肠道病毒EV71、CA16和其他肠道病毒。所用引物序列、扩增产物大小和配制如下:
引物 核酸序列(5’–3’) 产物长度 加DEPC水量(uL)
(1 OD配制25 uM) PE2 TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C 116 bp 156 PE1 ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC 180 EV71-S GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC 226 bp 196 EV71-A ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC 208 CA16-S ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC 208 bp 220 CA16-A TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG 208 应用的范围
标本处理3.1 粪便标本处理:
1.5ml Eppendorf管上标记标本号;
3.1.2每一管中加入900ul生理盐水、100ul 氯仿;
3.1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约0.1g约绿豆大小,加入标记好的离心管中,剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于 - 20℃。
3.1.4 确保拧紧离心管,用机械振荡器剧烈振荡20min。
1500g* (约3500转)离心20分钟。
3.1.6 将每一份标本上清吸入新1.5ml Eppendorf管中。
注意:若上清不清澈,应再用氯仿处理一次。以上标本处理方法适用于从患者排泄物、呕吐物(均简称样品)中提取病毒RNA。
3.2咽拭子标本处理
咽拭子要在保存液中充分搅动(40下左右)或用机械振荡器剧烈振荡5~10min,以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等,然后10000rpm 离心20min或4℃静置10min, 取上清吸入2个有外螺旋盖的标记好的冻存管中。
注意:以上标本处理方法适用于从疱疹液拭子、肛拭子(均简称样品)中提取病毒RNA。脑脊液、血清标本不需要处理可直接用于RNA提取。
3.3 提取病毒RNA模板
应用RNA提取试剂盒(GEN公司产品,Cat. No:)方法
nase-free ddH2O加入310ug Carrier RNA获得1 ug/uL的溶液。溶解后需分装保存于-20℃。(每管分装56uL可做10次提取)。此溶液反复冻融不能超过3次。
b Carrier RNA工作液配置:根据样品的数量计算所需裂解液RL和Carrier RNA溶液的体积,将裂解液RL与Carrier RNA溶液颠倒混匀,即得到Carrier RNA工作液。为避免溶液出现气泡现象,请勿使用涡旋振荡。
N × 0.56 mL=Y mL
Y mL × 10 uL/mL=Z uL
N-样品数目;Y-裂解液RL溶液体积;Z-需加入Carrier RNA溶液体积
注意Carrier RNA冻干粉不能直接溶解于裂解液RL中,必须先溶解在Rnase-free ddH2O中,再溶解至裂解液RL中。溶解后2-8℃最多能保存48小时,最好现用现配。
c 缓冲液GD、漂洗液RW 为浓缩液,第一次使用前加入无水乙醇(试剂瓶上标注的量)混匀,室温可储存1年。
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
提取病毒RNA模板:
3.3.1 吸取560 μl 含有Carrier RNA的L到1.5ml Eppendorf离心管中。
加140 μl到上述离心管中,回旋振荡15秒。
室温(15~25℃)孵育10 min。
短暂离心一次。
加560 μl乙醇(96~100%)到离心管中,盖上离心管帽,回旋振荡15秒。短暂离心一次。
从离心管中吸取0 μl溶液至nase-free吸附柱CR2中,注意不要滴到柱子边缘上。盖上离心管帽,6000g(8000rpm)离心1 min。把重复第6步的步骤加500 μl 缓冲液,盖上离心管帽,6000g(8000rpm)离心1 min。把加500 μl,盖上离心管帽,6000g(8000rpm)离心1 min。把00g(1000rpm)离心3 min。把1.5ml 无RNA酶离心管打开柱子帽,加入60μlnase-free ddH2
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