手足口病RT-PCR检测标准操作程序_TianGen_1_2..doc

手足口病RT－PCR检测标准操作程序（200年月日第1版） 标准编号：检测项目： 检测方法： PCR PCR仪器： Bio－Rad iCycler 检测原理 ’－UTR区基因序列及EV71、CA16的VP1－VP3基因序列，设计特异性引物（PE、EV71、CA16），通过Nested RT－PCR扩增基因片段，检测标本中是否存在肠道病毒EV71、CA16和其他肠道病毒。所用引物序列、扩增产物大小和配制如下： 引物 核酸序列(5’–3’) 产物长度 加DEPC水量(uL) （1 OD配制25 uM） PE2 TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C 116 bp 156 PE1 ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC 180 EV71-S GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC 226 bp 196 EV71-A ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC 208 CA16-S ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC 208 bp 220 CA16-A TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG 208 应用的范围 标本处理3.1 粪便标本处理： 1.5ml Eppendorf管上标记标本号; 3.1.2每一管中加入900ul生理盐水、100ul 氯仿; 3.1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约0.1g约绿豆大小，加入标记好的离心管中，剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于 - 20℃。 3.1.4 确保拧紧离心管，用机械振荡器剧烈振荡20min。 1500g* （约3500转）离心20分钟。 3.1.6 将每一份标本上清吸入新1.5ml Eppendorf管中。 注意：若上清不清澈，应再用氯仿处理一次。以上标本处理方法适用于从患者排泄物、呕吐物（均简称样品）中提取病毒RNA。 3.2咽拭子标本处理 咽拭子要在保存液中充分搅动（40下左右）或用机械振荡器剧烈振荡5~10min，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后10000rpm 离心20min或4℃静置10min， 取上清吸入2个有外螺旋盖的标记好的冻存管中。 注意：以上标本处理方法适用于从疱疹液拭子、肛拭子（均简称样品）中提取病毒RNA。脑脊液、血清标本不需要处理可直接用于RNA提取。 3.3 提取病毒RNA模板 应用RNA提取试剂盒（GEN公司产品，Cat. No：）方法 nase－free ddH2O加入310ug Carrier RNA获得1 ug/uL的溶液。溶解后需分装保存于-20℃。（每管分装56uL可做10次提取）。此溶液反复冻融不能超过3次。 b Carrier RNA工作液配置：根据样品的数量计算所需裂解液RL和Carrier RNA溶液的体积，将裂解液RL与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNA工作液。为避免溶液出现气泡现象，请勿使用涡旋振荡。 　　N × 0.56 mL＝Y mL 　　Y mL × 10 uL/mL=Z uL N－样品数目；Y－裂解液RL溶液体积；Z－需加入Carrier RNA溶液体积 注意Carrier RNA冻干粉不能直接溶解于裂解液RL中，必须先溶解在Rnase－free ddH2O中，再溶解至裂解液RL中。溶解后2-8℃最多能保存48小时，最好现用现配。 c 缓冲液GD、漂洗液RW 为浓缩液，第一次使用前加入无水乙醇（试剂瓶上标注的量）混匀，室温可储存1年。 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 提取病毒RNA模板： 3.3.1 吸取560 μl 含有Carrier RNA的L到1.5ml Eppendorf离心管中。 加140 μl到上述离心管中，回旋振荡15秒。 室温（15～25℃）孵育10 min。 短暂离心一次。 加560 μl乙醇（96～100％）到离心管中，盖上离心管帽，回旋振荡15秒。短暂离心一次。 从离心管中吸取0 μl溶液至nase-free吸附柱CR2中，注意不要滴到柱子边缘上。盖上离心管帽，6000g（8000rpm）离心1 min。把重复第6步的步骤加500 μl 缓冲液，盖上离心管帽，6000g（8000rpm）离心1 min。把加500 μl，盖上离心管帽，6000g（8000rpm）离心1 min。把00g（1000rpm）离心3 min。把1.5ml 无RNA酶离心管打开柱子帽，加入60μlnase－free ddH2