消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物学行为的影响.doc

消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物学行为的影响 消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物学行为的影响 结肠癌是常见的恶性肿瘤，其发病率在男性和女性中分别位居第3位和第2位，且有逐年上升趋势[1]。 　　结肠癌属中医学“肠蕈”范畴，多因饮食失节、脾胃受损、湿热壅聚成痰而搏结肠腑所致。消痰通腑方为魏品康教授从痰论治消化道肿瘤核心治则“消痰散结八法”之一。磷脂酶A2是一类可催化脂肪酸水解并产生以花生四烯酸为主的游离脂肪酸酶，具有产生炎性介质、参与细胞信号转导等多种功能，在人类肿瘤发生、发展中发挥重要生物效应[2]。环氧化酶是PLA2催化AA生成生物活性分子的限速酶，包括COX-1和COX-2。研究表明，COX-2在结肠中过度表达，其与细胞增殖、分化等有关[3]。本研究采用消痰通腑方干预结肠癌SW480细胞，观察其对细胞增殖、迁移的影响，探讨其分子作用机制。 　　1 实验材料 　　 细胞株 　　人结肠癌SW480细胞，中国科学院上海细胞库。 　　1.药物及制备 　　消痰通腑方由制半夏、制南星、大黄、陈皮、鸡内金、炙甘草组成，所有饮片由上海雷允上药业有限公司提供。消痰通腑方由第二军医大学试剂中心制备，按比例称取10倍量的饮片，加8倍体积的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次1 h，将煎液合并后离心、浓缩、干燥至干品即得消痰通腑方醇提物，其得率为1 g原药材/。等比例换算至药物浓度分别为、/mL。实验前称取适量醇提物干粉，经涡旋、超声、水浴等方法使其充分溶解于DMEM培养基后，μm滤器过滤并配置成所需浓度的溶液，℃冰箱贮存备用。 　　1.主要试剂与仪器 　　DMEM培养基，胎牛血清，%胰蛋白酶、青链霉素混合液，qPCR、cDNA反转录、总RNA提取试剂盒，transwell小室，CCK8溶液，PLA2抗体，COX-2抗体，PLAshRNA质粒，shRNA对照质粒，shRNA质粒转染试剂，均购自Santa cruz公司。 　　超净工作台，CO2培养箱、BIOMATE型紫外可见分光光度计，LXJ-ⅡA型离心机，GE485型PCR仪，DYCZ-24DN电泳仪，Tocan500全自动凝胶成像系统。 　　实验方法 　　 细胞培养及药物干预 　　结肠癌SW480细胞常规培养于含10%FBS和1%青-链霉素双抗DMEM培养基，每隔1～d换液，待细胞融合约80%时进行细胞传代及种板。消痰通腑方原药材浓度为/mL，经μm无菌过滤器过滤，用培养基稀释成实验所需浓度。实验根据药物浓度分为对照组、低剂量组、高剂量组。 　　法检测 　　取对数生长期上述3组细胞，经胰酶消化后，接种于96孔板，每孔细胞数为1×103。每组设5个复孔。分别于24、48、72、96、120 h后加10 μL CCK-8溶液。置于培养箱培养h，于酶标仪波长450 nm处测定细胞吸光度值，计算细胞相对增殖率[÷对照组A值×100%]。 　　2.平板克隆形成实验 　　取对数生长SW480细胞悬液梯度倍比稀释后，接种于6孔板中，每孔50个细胞。置于培养箱内培养2h，各组分别加入各浓度消痰通腑方本文由论文联盟http://收集整理溶液，重新置于培养箱中，经常观察，当出现肉眼可见克隆时，弃去上清液，PBS清洗2次，甲醇溶液固定1min后加Gimesa染液染色。计算克隆细胞数目。实验重复3次，取其平均值。 　　小室实验 　　收集3组细胞，800 r/min离心min，PBS清洗2次，用培养基重悬并调整细胞浓度为1×109/L。分别取100 μL细胞液置于Transwell小室上层，同时在下层加500 μL DMEM培养基。3℃培养箱中培养4h，擦净小室滤膜上层的细胞。4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗并用结晶紫染色。每组同时做3个重复小室，200倍显微镜下计数并拍照。 检测结肠癌SW480细胞磷脂酶A2和环氧合酶mRNA表达 　　从Gene Bank网站获取PLA2、COX-2基因序列，并使用软件设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用Trizol试剂提取细胞总RNA，每份样品均取μg，按试剂盒说明进行反转录。以Tubulin为内参，PLA2、COX-2表达的相对定量值用于统计分析。 　　 blot检测结肠癌SW480细胞磷脂酶A2和环氧合酶2蛋白表达 　　用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解并收集细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度后加入上样缓冲液，煮沸变性。样品进行SDS电泳，电转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭h后，特异性一抗℃摇床过夜，洗膜后，二抗孵h，EC显影。 　　转染实验 　　人结肠癌SW480细胞分为PLAshRNA干扰组、质粒对照组、对照组，每组设