第四次分生讨论课问题四整合概述.ppt

（2）cDNA的获取 分为以下几个步骤： Ⅰ.小鼠卵透明带糖蛋白2的mRNA的提取 Ⅱ. mRNA的逆转录为cDNA Ⅲ. cDNA形成双链进行扩增 Ⅰ.小鼠卵透明带糖蛋白2的mRNA的提取Ⅱ. mRNA的逆转录为cDNA 利用TRIZOL 发抽提雌性小鼠的卵细胞中的所有RNA得到以下图示结果： 5’m7Gppp --------------------------------- AAA 3’(抽提的mRNA） 5’m7Gppp --------------------------------- AAA 3’ （mRNA） ---------------------------------- （cDNA） Oilgo（dT）引物 特异性设计的引物 （只对卵透明带糖蛋白2mRNA中序列特异性识别） AMV反转录酶，缓冲液 第一股链合成 ≈45℃，60min Ⅲ. cDNA形成双链进行扩增  5’m7Gppp --------------------------------- AAA 3’ （mRNA） ---------------------------------- TTT （cDNA） ----------------------------------AAA3’ ----------------------------------TTT5’ RNase H DNA-pol Ⅰ 缓冲液 第二股链的合成 ≈14℃ 2h 双链DNA 得到稳定的cDNA双链（也就是得到了AK135903.1号cDNA） （3）cDNA的扩增 首先我们必须得设计好引物，本次实验的目的是扩增出133-1941位中的核苷酸链。因此在扩增之前必须得先设计primer 设计引物的方法： 走 以下是设计引物的一个过程： 设计引物的过程： 使用pubmed中查找到AK135903.1的cDNA序列后使用 后进入页面后可以筛选出建议的primer。经过之前讲的原则的分析后得到了一对扩增引物（包含了133-1941位点的扩增片段） 见下所示 Tm:55-65℃ GC%：40%-60% cDNA的扩增 ----------------------------------3’ 5’----- forward primer Reverse primer -----3’ ----------------------------------5’ 进行PCR扩增 进行PCR扩增后，就得到高浓度的cDNA分子了 （4）cDNA的后续处理 获得高浓度的cDNA分子之后，由于末端扩增出的片段与表达载体并不匹配，因此为了更好的进行表达载体的构建，因此我们还需要对获得懂得cDNA进行后续的处理。 以下为扩增后的cDNA分子处理： ----------------------------------AAA3’ ----------------------------------TTT5’ ----------------------------------AAA3’ ----------------------------------TTT5’ T4DNA连接酶 dNTP 人工合成接头 修齐末端 37℃ 10min 人工接头 2.表达载体的选择与构建 （1）表达载体的选择 我们从题目中知道扩增出来后的基因序列＜10k 一般选用质粒作为表达载体。一下是有关表达载体的对比示意图。 （2）表达载体的构建 目的基因与表达载体的构建 人工合成的基因接头常常在表达载体上都有特定的限制酶切割位点，用同样的限制酶对表达载体进行切割后进行拼接。 剪接好的cDNA ------------------ 剪接好的质粒 在DNA连接酶的作用下连接 表达载体构建成功 PCR引物的选取原则 ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧ 引物5′端可以修饰。 ⑨