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 1 限制性片段长度多态性(RFLP) 限制性片段长度多态性( RFLP) 是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后, 含同源序列的酶切片段在长度上的差异。 Botsten等于1980年首先提出用RFLP构建遗传连锁图, 其基本原理是将不同生物个体的基因组DNA分子采用适当的限制性内切酶切割, 将酶切片断电泳后利用探针杂交并放射自显影,就可以得到与探针高度同源的DNA带型。由于植物不同种、属间甚至品种间同源序列的限制性内切酶识别位点各不相同, 因此通过比较RFLP片段的多态性,就可以揭示种、属间甚至品种间的差异及相关性。 RFLP标记优缺点 RFLP标记具有共显性、可以区别纯合和杂合基因型、稳定、重复性强等优点。目前在某些生物体中开发的RFLP的探针已经遍及整个基因组。 然而由于RFLP具有种属特异性，技术复杂，对DNA需要量大、纯度要求高且所需的放射性探针对人体危害大， 所以使其应用受到很大限制，此技术在医学上有所发展外，在植物学研究上已经极少使用, 在中药上的应用前景也不被看好。 RFLP标记的应用 2006年, 高晓霞等利用真核生物通用引物扩增rDNAITS序列并对扩增产物进行RFLP分析, 其ITS-RFLP酶切图谱显示可以对佛手和香橼基缘植物进行分子鉴定。 2005年, 张婷等对束花石斛、流苏石斛及其形态相似种进行研究, 通过PCR-RFLP方法获得ITS片段的限制性图谱。结果显示根据所得的PCR- RFLP图谱, 可以鉴别药用植物束花石斛、流苏石斛及它们的形态相似种。并用这种方法鉴定了市场上收集的25件商品束花石斛、流苏石斛新鲜药材的原植物。 2004年,赵宣等人用PCR-RFLP方法成功的分析了牡丹组植物种间的关系, 并获得了相应的分子证据。另外, 苍术属、甘草属、北沙参、柴胡等也有应用RFLP进行资源分析的报道。 2 随机扩增多态性DNA (RAPD) 随机扩增多态性DNA(RAPD) 是利用一系列( 通常是数百个) 不同的碱基随机排列的寡聚核苷酸( 通常为9~10个碱基) 单链作为引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过电泳分离、溴乙锭( EB) 显色来检测扩增DNA片段的多态性, 这些扩增的DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。 RAPD技术的优缺点 相对于RFLP来说, RAPD技术具有技术简便易行、成本低、DNA用量少、引物无种属特异性以及不使用放射性同位素等优点, 其缺点则主要表现在稳定性差、易受外界条件影响、不能鉴定杂合子、结果分析较困难。RAPD技术发展极为迅速, 广泛应用于各属种的种质资源鉴定研究之中, 是目前种质资源鉴定中应用最多的分子标记技术。 由于RAPD稳定性差, 因此, 在应用RAPD进行研究时, 应积极摸索最佳反应条件以及各影响因子对反应结果的影响情况, 以便于对研究结果进行比较, 并为其应用于生产打下基础。 RAPD技术的应用 2007年, 李明军等研究了山药基因组DNA的提取方法并对Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优化, 且声称建立了山药RAPD技术体系, 得到了29个山药品种的RAPD指纹图谱, 在分子水平上为山药种质资源的品种分类、质量评价以及核心种质的构建提供了依据。 同年,严奉坤等建立了一种适于分析的快速提取枸杞叶片基因组的方法, 并利用筛选出的2个随机引物对10份枸杞材料基因组进行了RAPD扩增, 构建了枸杞属基因组指纹图谱, 为运用RAPD技术对枸杞基因组进行指纹图谱分析从而进行道地品种的鉴别、遗传多样性及亲缘关系的研究提供了参考。其他如三七、山东瓜蒌、广藿香、天麻、冬凌草、贝母、巴戟天、苦叶七等药用植物也都有应用RAPD技术进行种质资源鉴定研究的报道。 然而目前大部分研究还仅局限于探讨RAPD技术在某一种属药用植物种质资源鉴定中应用的可能性上。 3 扩增片断长度多态性(AFLP) AFLP是在RFLP和PCR的基础上发展起来的, 其基本原理是通过选择性扩增基因组DNA的酶切片段来获得不同DNA样品之间的遗传差异。 生物基因组DNA经限制性内切酶酶切后, 产生分子量大小不同的限制性片段。将特定的人工合成的短的双链接头连在这些片段的两端, 形成一个带接头的特异片段, 通过接头序列和PCR引物3′-端选择性碱基的识别, 对特异性片段进行选择性扩增。选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性, 只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经凝胶电泳分离检测, 根据扩增片段长度的不同检测出多态性。 AFLP标记优缺点 AFLP技术兼有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性, 具有快速、灵敏、稳定、所需DNA量少、多态性检出率高、重复性好、适应性