核盘菌病毒dsRNA提取方法描述.docVIP

湖南农业大学 课程实验设计书 项目名称： ： 指导老师姓名： 所在学院： 联 系 电 话： 生物化学与分子生物学实验技术课程组 二〇一年月制 前 言[] 主要包括：(1)为什么要写这篇实验设计,要解决什么问题；(2)本设计在学科领域中所占的地位,有什么意义和价值；(3)本设计所涉及的界限、规模和范围；(4)理论依据和实验设备基础；(5)预期目标；(6)概念和术语的定义。 核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Ｌib.)de Bary)是一种重要的植物病原真菌，在我国常年严重为害油菜、向日葵和大豆等油料作物及多种蔬菜作物。由于该菌在病残体上形成的菌核可以在土壤中顽固存活，给防治带来了极大的困难。目前核盘菌引致的作物(包括蔬菜)菌核病仍然依赖于化学农药防治，化学农药防治在一定程度上可确保作物的产量，但也造成了严重的后果，其主要有两个方面:(1)由于长期大量使用农药，核盘菌群体中已出现了抗药性菌株;(2)农药给环境(空气、水和土壤)造成了严重的污染，特别是直接污染了食品(食用油和蔬菜等)。考虑到‘农业持续性发展的要求，环境问题的紧迫性及食品卫生等诸多因素，降低化学农药使用剂量和频次势在必行。利用抗病品种和生物防治是替代化学农药防治菌核病的最佳途径。但目前这两种措施均没有取得突破性进展，其主要原因是对核盘菌的认识不够。深入了解核盘菌的致病机理及病菌致病力(毒力)衰退的机理将为菌核病的防治研究提供新的思路和线索。 真菌在生命之树上占据了极其重要的地位，其多样性及进化地位已获得充分认识肯定（刘慧泉，2011)。真菌病毒是一类能感染真菌并且能在真菌中有效复制的病毒，虽被证实广泛存在于各类真菌中，与动物病毒和植物病毒相比而言，研究却相当滞后，与分布广泛的真菌类群形成鲜明对比。目前关于真菌病毒分布及寄主范围的研究报道很少，基因组已被测序和报道的真菌病毒就更加少之又少，究其原因，主要是由于大部分已知的真菌病毒对寄主真菌造成的表型影响非常微小，难以被发现，不容易引起研究者的注意；另一方面，伴随着弱毒菌株现象的发现，真菌病毒学者开始对能够导致植物病原真菌致病力降低的真菌病毒产生兴趣，对此类病毒的研究投入了极大的精力，以期将其开发成能对抗真菌病害的生防制剂，或作为研究工具来探究真菌宿主的生理机制（Ghabrial et al, 2009b; Pearson et al, 2009)。 有关真菌病毒的首次报道是在1962年，英国科学家Hollings等在双孢蘑燕里发现了三种真菌病毒粒体。此后从许多真菌中先后发现了多种病毒存在，据估计至少有30%的真菌中携带有病毒，说明真菌病毒的分布较广泛（Lemke, 1979; Buck,1986)。到目前为止，所发现的绝大多数真菌病毒粒子是球形的，除此之外还有线状、棒状、杆状、有囊膜的杆状以及疱疫病毒等形状存在（Pearson e/a/., 2009)。真菌病毒基因组核酸大多是dsRNA或( + )ssRNA，其巾以dsRNA为主(Buck, 1986)，于晓等在2010年首次报道了真菌巾存在ssDNA真菌病毒。真菌病毒分布广泛，几乎存在于所有的真菌中，但关于病毒分类的研究却还处于起步阶段，根据基因组片段数目，目前所发现的dsRNA真菌病毒可分为以下四大类：Reoviridae (呼肠孤病毒科)、Totiviridae (单分病毒科)、Chyroviridae (产黄青霉病毒科）和Parirsviridae(双分病毒科），而ssRNA病毒可分为Hypoviridae (弱毒病毒科）、Namavirida(裸露病毒科）和杆菌状核糖核酸病毒科（Bamaviridae)。近期在植物上发现了 单分体dsRNA病毒，进化上介于单分病毒科病毒和双分病毒科病毒之间（Martinet al.，2011; Sabanadzovic et al, 2009)；在白纹羽病菌巾发现了一种大型的双分体dsRNA病毒，与单分病毒科和产黄青霉科成员的亲缘关系较近，这都证明了部分真菌病毒与植物病毒具有一定的同源性。真菌病毒核酸序列已测定的还很少而针对真菌病毒基因组相关分子生物学特性的广泛研究，病毒的核酸序列也成了真菌病毒分类的重要依据之一（Hong e? a/., 1999)。目前还有部分真菌病毒的分类地位未确定，因此，发现新的真菌病毒并测定其核酸序列，对真菌病毒的研究非常重要大多数的真菌均被证实里面含有病毒，而对真菌病毒传染性检测的缺乏，使得由病毒引起的表型变化难以确定，目前，仅有部分病毒已被证明确凿导致一个特定的表型。真菌病毒无处不在，但缺乏使寄主表型明显变化的效果，导致数研究者认为真菌病毒，真菌生物学没有发挥作用。但我们目前研究的真菌病毒数量有限，因此，如果仅凭所得到的一些数据而做出对所