玉米低磷應答转录因子ZmPHR1的克隆及功能分析.docVIP

玉米低磷应答转录因子ZmPHR1的克隆及功能分析 【摘要】：玉米(ZeamaysL.)是世界上重要的粮食、经济和饲料兼用型作物。大部分玉米种植于热带和温带的酸性或碱性土壤中,而磷素作为植物重要的营养元素之一极易被酸性土壤中的Fe3+、Al3+以及碱性土壤中的Ca2+结合形成难溶性化合物,导致土壤中有效磷缺乏,最终严重影响玉米的产量和品质。尽管磷肥的施用能够缓解土壤中有效磷缺乏的问题,但是随之而来的是引起更多磷素在土壤中被固定、流失、水体富营养化以及磷矿资源的缺乏等一系列问题。研究表明,只有极少数玉米自交系属磷高效利用型。所以,培育低磷条件下的磷高效利用型玉米种质为育种所用,是我们迫切需要解决的问题。磷的利用效率是一个受多基因控制的数量性状,导入单个功能基因并不能达到改善某一个数量性状的效果,而单个转录因子的导入可以调控下游多个基因的表达,因此,将转录因子作为研究对象以期提高玉米的磷利用效率。到目前为止,磷利用相关转录因子的研究以拟南芥和水稻中AtPHR1和OsPHR2研究最为详尽,二者都属于MYB-CC转录因子家族,而且在进化上同源,且已被证明是磷饥饿响应的重要调控因子,在植物磷积累调控中起重要作用。然而,在玉米中,尚未有与PHR1类似的转录因子的报道。从筛选到的磷高效利用型玉米材料中克隆与AtPHR1同源的基因,并对该基因的序列特征、特性以及功能进行了分析研究。主要结论如下：1.对36份玉米材料进行低磷胁迫处理,采用影响磷利用效率的两个关键因素干物质量和磷积累量的绝对值和相对值进行综合评价,并辅助以生理生化特性分析,最终筛选出磷高效利用型玉米材料478和太系113。2.以AtPHR1为基础序列,利用序列相似性分析方法,从磷高效利用型玉米材料478中获得一个氨基酸序列。生物信息学分析表明,该序列编码一个含有449个氨基酸的蛋白,与AtPHR1、OsPHR1和OsPHR2的一致性分别为43%、64%和45%:具有与AtPHR1.OsPHR1和OsPHR2一样高度保守的MYB-DNA结合域和CC结构域,属于一个新MYB-CC转录因子家族,命名为ZmPHR1。系统进化树分析表明,2mPHR1与AtPHRl,OsPHR1,OsPHR2同属一个亚类,相比AtPHR1,与OsPHR1、OsPHR2的亲缘关系更近一些。ZmPHR1基因位于玉米第1条染色体长臂上。基因结构分析表明,ZmPHR1具有7个外显子和6个内含子,与AtPHR1和OsPHR1的基因结构相似。3.利用基因枪法将含有ZmPHR1::GFP融合蛋白的植物表达载体导入洋葱表皮细胞。结果表明,仅在核内观察到GFP荧光,说明ZmPHR1在核内表达,为一个MYB-CC转录因子。RT-PCR分析表明,无论高磷还是低磷培养,ZmPHRl在不同组织器官中均有表达,在叶中表达量最高,根中次之,茎中最弱,属组织特异性表达。qPC(?)进一步分析表明,随着磷饥饿处理时间的延长,ZmPHR1的表达量处在一个动态变化中,存在一个正负反馈调节。4.通过农杆菌浸染花蕾法将含有ZmPHR1::GFP的植物双元表达载体导入拟南芥,通过潮霉素抗性筛选、DNA-PCR、RT-PCR和GFP检测,获得过量表达的转基因拟南芥株系。5.通过对拟南芥ZmPHR1过表达株系和野生型株系的表型对比分析得出,相比野生型株系,ZmPHR1的过量表达明显改善转基因植株的生长。特别是在低磷条件下,相比野生型株系,过表达株系的茎叶干重和无机磷含量均显著提高。6.通过对拟南芥磷饥饿响应基因的表达分析得出,在低磷条件下,相比野生型株系,ZmPHR1过表达株系的根和茎叶中的AtIPS1、AtPS2、AtPS3和AtRNS1的表达均上调,并且同时上调了根中磷转运蛋白基因Pht1;2、Pht1;8和Pht1;9的表达,推测这些基因的上调是植株生物量和无机磷含量提高的原因。【关键词】：玉米磷利用效率有效磷缺乏MYB-CC转录因子ZmPHRl 【学位授予单位】：山西大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2013 【分类号】：S513 【目录】：中文摘要10-12ABSTRACT12-15第一章引言15-291.1磷在植物中的重要性及其存在形态151.2土壤磷的状况及磷肥施用存在的问题15-161.3植物对低磷的应答机制16-191.3.1根构型的变化16-171.3.2有机酸的分泌及根际pH值的变化171.3.3酸性磷酸酶活性的变化17-181.3.4核糖核酸酶活性的变化181.3.5磷转运蛋白的表达及分类18-191.3.6膜脂过氧化和保护酶系统变化191.4缺磷响应基因的研究进展19-221.4.1缺磷响应基因的时空表达谱研究19-201.4.2磷响应功能基因的研究20-211.4.3植物磷饥饿响应转录因子的研究21-221.5PHR