生化實验分析.docVIP

果蔬成分生化分析1、掌握微量测定维生素C的方法和技术。2、了解果蔬中维生素C含量。 掌握总糖和还原糖含量的测定方法。 了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。 还原型维生素C可被氧化型2，6-二氯酚靛酚（下面简称染料）所氧化，成为氧化型维生素C。氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。成为还原型后为无色。用氧化型染料来滴定还原型维生素C，当滴至全部还原型维生素C被氧化后，在稍滴一点呈微红色为终点。滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。此法虽简单迅速，但氧化型染料亦能使其他还原型物质氧化，所以有一定缺点。620nm处有最大吸收。多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。 用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质，主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。 1%草酸溶液2%草酸溶液维生素C标准液氧化型0.1% 2，6-二氯酚靛酚溶液各种果蔬蒽酮试剂标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL6mol/L HCl溶液20% NaOH溶液操作1、制备新鲜果蔬液：如洗净新鲜橘子，擦干表面水分，剥去外皮，称20.0g橘子放入50mL量筒中，加2%草酸液至40mL刻度处（即稀释1倍）。用玻璃棒搅拌，静置10分钟，过滤，滤液即是染料。 2、染料液装入滴定管中：应驱除滴定管中的气泡，调整好零点。 3、滴定维生素C标准液：吸取1.0mL维生素C标准液放入锥形瓶中，加9mL1%草酸溶液，摇匀，用染料液滴定至微红色保持15秒不褪色即为终点。记下所用去染料液数量，可算出1mL染料相当于多少mg维生素C。 4、滴定样品液：吸取10.0mL样品液放入锥形瓶中，同上操作进行滴定。可做两份，求平均值。1、葡萄糖标准曲线的绘制以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）为横坐标做图得标准曲线。 2、样品中还原糖的提取和测定 称取1实验材料，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30mL蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50℃水浴中保温约0.5h（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100mL。过滤。取1mL液置于试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4mL蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同。测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。 3、样品中总糖的提取、水解和测定 称取1g实验材料，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12mL蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10mL，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h，冷却后用20%NaOH溶液中和至pH呈中性。然后用蒸馏水定容至100mL，过滤。。取1mL总糖液同上法进行还原糖测定。 0 1 2 3 4 5 标准葡萄糖溶液/mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 置冰水浴中5min 蒽酮试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 煮沸10′，冷却后室温放置10′，在620nm处比色 A620nm 葡萄糖标准曲线 还原糖： 由标准曲线的溶液的浓度为： 计算结果： 萝卜 0.246 0.027mg/ml W= ×100%=2.7% 盘菜 0.337 0.037mg/ml W=3.7% 总糖： 萝卜 0.427 0.047mg/ml W=4.7% 盘菜 0.354 0.039mg/ml W=3.9% 结果分析： 在绘制葡萄糖标准曲线时，应使图上的点尽量聚集在直线附近，各标准液浓度与该溶液的吸光度呈线性关系，测定计算时可先根据标准液浓度查出该溶液的浓度，产生误差的可能的原因有：1.标准曲线绘制不够准确； 2.实验过程中蒽酮试剂加进去后未摇匀； 3.蒽酮加入的时间存在着间隔。 3.果蔬中蛋白质含量的测定——考马斯亮兰法 操作： 标准曲线绘制 加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。 以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。 2、样品制备 称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mLH2O或0.05mol/L Tris－HCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2mL水或缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心15～20min，其上清液即为蛋白质的提取液，供分析用。 3、样品测定 试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.