(第八)第九植物原生质体培养与体细胞杂交.pptVIP

第三节 植物原生质体培养方法 2、胞质环流法： 以具有胞质环流者为有旺盛代谢活力的指标。 3、荧光素双醋酸酯（FDA）染色法： （ 用较多 ） FDA本无荧光，无极性，可自由渗透进出完整质膜，当原生质体具活力时，FDA能为原生质体的酯酶分解而成具荧光的极性物，不能再进出质膜，只累积在具活力的原生质体内，死细胞无此具荧光物质，在荧光显微镜下检查时，便解把它们分辨出来。 第三节 植物原生质体培养方法 4、渗透压变化法： 原生质体体积能随介质渗透压变化而改变者为活原生质体。 5、用氧电极法 测定原生质体的耗氧率来估测原生质体相对活力。 上述方法各有特点。 第三节 植物原生质体培养方法 三、植物原生质体的培养 原生质体游离纯化后，经过活力鉴定，必须在适宜的培养基上，接种一定的密度，采用适当的培养方法才能正常地生长发育，最终再生完整植株。 第三节 植物原生质体培养方法 （一）原生质体培养基 原生质体培养和组织培养、细胞培养一样，培养基中需要氮、磷、钾、钙、镁、硫及铁等大量元素，以及锰、锌、钼、铜、钴和碘等微量元素作营养源。同时还需要糖类物质作碳源和许多有机营养。 为了补充内源激素的不足，在培养基中需添加适当浓度的激素。但由于原生质体与植物细胞相比，缺乏的是细胞壁，因此，原生质体培养基的某些成分又与细胞培养的培养基略有不同。 第三节 植物原生质体培养方法 主要变化包括去掉铵盐，降低铁和锌的浓度，提高钙的浓度，用蔗糖、核糖补充葡萄糖，添加维生素（生物素、叶酸和核黄素）、糖醇（山梨醇、甘露醇、木糖和甘露糖等），有机酸（柠檬酸、苹果酸和延胡索酸等）以及成分尚不清楚的营养物质（椰子汁等）或者是变更所用的生长调节物质。 Kao和Michayluk（1975）（培养蚕豆属种的原生质体）为适应低密度培养，设计了一种复杂培养基，即KM培养基，其中含有丰富的有机成分，包括维生素、氨基酸、有机酸、核苷酸、糖和糖醇以及植物生长所必需的无机营养成分。后来，这个培养基在原生质体培养中得到广泛应用。 第三节 植物原生质体培养方法 （二）培养物密度 与细胞培养相似，原生质体初始密度对植板效率有显著的影响。原生质体培养的一般密度是每毫升培养基1×104到1×105原生质体。 在体细胞杂交和诱发突变的研究中，最好是能获得来源于单个细胞的无性系。为此就需要在低密度下（每毫升培养基100～500个原生质体）培养原生质体或由原生质体产生的细胞。 第三节 植物原生质体培养方法 （三）培养方法： 原生质体的培养方法有很多，大多数与细胞培养相同。如：琼脂培养法（1、琼脂包埋法〈平板法〉）、饲养层培养法（3、饲喂看护培养法）、共培养法、小滴培养法以及悬滴培养法等等。 如果按照培养基的类型，又可以分为三类，即：固体培养法，液体培养法及固液结合培养法。 第三节 植物原生质体培养方法 1、固体培养法：（平板培养法） 该法是指将原生质体在液体培养中形成细胞壁后再与0.6%的琼脂混合，或者在原生质体游离后，立即与琼脂的培养基混合。由于原生质体被机械地彼此分开并固定了位置，此法避免了细胞间有害代谢产物的影响，也使原生质体彼此间不会聚集成团，因而可以对各个原生质体克隆进行跟踪观察。 饲养层培养法是固体培养法的引伸。 其培养法也是饲养层培养法的一种方式。 第三节 植物原生质体培养方法 2、液体培养法： 该法是指在培养基中不加凝胶剂，原生质体悬浮在液体培养基中。常用的是液体浅层培养法，即将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。这种方法操作简便，对原生质体伤害较小，且便于添加培养基和转移培养物，是目前原生质体培养工作中广泛应用的方法之一。其缺点是原生质体在培养基中分布不均匀，容易造成局部密度过高或原生质体互相粘连而影响进一步的生长和发育，并且难以定点观察单个原生质体的发育过程。 小滴培养是液体培养的一种方式。 第三节 植物原生质体培养方法 3、固液结合培养法：（双层培养法） 最简便的固液结合培养法是在培养皿的底部先铺一薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进行原生质体的液体浅层培养。这样，固体培养基中的营养成分可以慢慢地向液体中释放，以补充培养物对营养的需求。培养物所产生的有害物质，也可被固体部分吸收，对培养物的生长更为有利。 念珠培养法实际上是固液结合培养法的一种方式。 还可以据研究材料、目的不同，在此基础上引伸和发展，创出新方法。 第三节 植物原生质体培养方法 原生质体培养程序包含：原生质体分离、原生质体纯化、原生质体培养、原生质体胞壁再生、细胞团形成和器官发生。 原生质体培养程序 程 序 技 术 关 键 原生质体分离 （1