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三种治法体外抗流感病毒的实验研究 nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp; 作者：周坤福，刘琳琳，陆平成 【关键词】nbsp; 清热解毒法 nbsp;nbsp;nbsp; 清热解毒法是临床治疗流感病毒性肺炎常用方法，宣肺化痰也是治疗该病的一个重要治法，近年来应用养阴清肺法在临床辨证治疗流感病毒性肺炎也有一定疗效。本研究试图从中医外感理论出发，由流感病毒入手，通过实验来观察上述三种治法抗流感病毒的作用，探讨其机制。 nbsp;nbsp;nbsp; 1nbsp; 材料与方法 nbsp;nbsp;nbsp; 1.1nbsp; 材料 nbsp;nbsp;nbsp; 1.1.1nbsp; 药物nbsp; 清热解毒治法用方采用金银花、连翘各12 g，贯众、蚤休各15 g，香薷10 g；宣肺化痰治法采用麻杏石甘汤原方：麻黄、杏仁各9 g，生石膏18 g，甘草6 g；养阴清肺治法用方采用生地、玉竹各15 g，金银花12 g，鱼腥草20 g，黄芩10 g。各生药由南京中医药大学附属中医院门诊提供。按常规制成100％水煎液，注射鸡胚所用药液均以1500 rpm低速离心5 min，取上清液置高压锅中灭菌30 min，置4 ℃冰箱内放置备用。利巴韦林：100 mg/片，华北制药集团制药业有限公司，批号：040646。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.1.2nbsp; 鸡胚nbsp; 10日龄SPF鸡胚，购于南京生物药厂养殖中心。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.1.3nbsp; 病毒nbsp; 流感病毒FM1株由南京中医药大学微生物教研室提供。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.1.4nbsp; 实验设备nbsp; 隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂产品，型号：PYX-DHS-50×65；净化工作台，吴江市净化设备厂产品，型号:YJ-875SDB；电热手提压力蒸气消毒器，上海医用核子仪器厂产品，型号：YXQ·SG4·280。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2nbsp; 方法 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2.1nbsp; 病毒制备nbsp; 将病毒液和生理盐水1∶20稀释注射鸡胚后置37 ℃温箱，48 h后放4 ℃冰箱过夜，取鸡胚尿囊液进行血凝实验。大孔塑料板内用生理盐水将尿囊液先按1∶10稀释，再进行倍比稀释1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1280，1∶2560，1∶5120，共得10个浓度梯度。每孔加入0.5%的鸡红细胞悬液，摇匀，静置45 min后观察。根据血细胞凝集程度的不同来进行判断，以（++）为终点，即观察到红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块，以此为标准测定血凝滴度［1］。取血凝滴度在1∶640以上的尿囊液混合并分装无菌试管，低温冰箱保存备用，作为实验用病毒液。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2.2nbsp; 鸡胚半数感染量的测定nbsp; 取出病毒1支，快速融化后置冰水杯中，用生理盐水按10倍稀释至10管。40只鸡胚，随机分为10组，每管接种4个胚。培养48 h后，取尿囊液加等量0.5%鸡红细胞悬液做血凝实验，出现血凝者为阳性。用Reed-Muench法［1］计算鸡胚半数感染量EID50为10～8.67。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2.3nbsp; 中药对鸡胚毒性作用测定nbsp; 将中药和利巴韦林分别以灭菌生理盐水连续做2倍稀释，各3个浓度，分别接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.2 ml，每个浓度接种5胚，37 ℃孵育，连续观察鸡胚生长发育情况。以鸡胚可存活96 h的最大浓度作为药物的最大无毒剂量。测定结果：最大无毒剂量清热解毒方为6.24 g/kg，宣肺化痰方为16.38 g/kg，养阴清肺方为7.02 g/kg，利巴韦林为0.07 g/kg。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2.4nbsp; 分组、造模及给药nbsp; 取60只鸡胚随机分为6组：正常组、模型组、阳性组、清热解毒组、养阴清肺组和宣肺化痰组。模型组与阳性组用病毒接种后，分别再以生理盐水与利巴韦林注射。三种治法方药组各采用三种方法，（1）对病毒的直接杀灭作用：将稀释好的药液与病毒等量混均后接种鸡胚；（2）对病毒的预防作用：鸡胚先注射中药，37 ℃温箱1 h再接种流感病毒；（3）对病毒的治疗作用：鸡胚先接种流感病毒液，37 ℃温箱1 h再注射中药。病毒剂量均为100E