与肺癌源性hsp70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析.docVIP

与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析 nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp; 作者：杨继要,张慧珍,王静,吴逸明,买淑鹏 【摘要】nbsp; 目的 从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选与肺癌源性HSP70特异性结合的融合抗体。 方法 以肺癌源性的HSP70为抗原,对人源性肺癌噬菌体单链抗体库中经四轮筛选,单克隆噬菌体抗体与抗原HSP70结合经ELISA检测筛选出阳性菌株，再经PCR进一步鉴定，确定含有单链抗体基因的克隆并测序，测序结果通过GeneBank 比对进行同源性分析。结果 获得了1个特异性强的阳性噬菌体克隆。经DNA 测序后,在Genebank 中与人的免疫球蛋白库进行比对,确定为单链抗体片段。结论 从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选到与HSP70特异性结合的具有功能活性的单链融合抗体,为进一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤治疗奠定了基础。 【关键词】nbsp; 肺癌；噬菌体抗体库；HSP70；筛选 nbsp;nbsp;nbsp; Identification and Sequence Analysis of Fused scFvnbsp; Antibody Binding Specifically to HSP70 nbsp;nbsp;nbsp; Key words：Lung cancer；Phage antibody library；HSP70；Biopanning nbsp;nbsp;nbsp; 热休克蛋白70（Heat Shocknbsp; Protein 70,HSP70）在很多肿瘤中高表达，研究表明[1，2]，肿瘤细胞的HSP70特异性表达于细胞表面，与正常组织细胞的细胞内表达不同。 nbsp;nbsp;nbsp; 本研究从构建的人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选抗HSP70抗体，旨在寻找有临床应用价值的抗体，为肺癌免疫治疗奠定理论基础。 nbsp;nbsp;nbsp; 1材料和方法 nbsp;nbsp;nbsp; 1.1材料 人源性肺癌噬菌体单链抗体库由我室张慧珍博士构建，库容为1.2×1012，-70℃保存。TG1大肠杆菌、KM13辅助噬菌体为本实验保存。鼠抗M13 单克隆抗体购自Amersham 公司。鼠抗人HSP70一抗、兔抗鼠二抗购自北京中山公司，抗原HSP70由我研究室从肺癌组织中提取总蛋白，经过ConA亲和柱、透析、DEAE离子交换柱获得，经WESTERN-BLOT 鉴定具有抗原性。胰酶及其他试剂为国产分析纯。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2方法 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2.1辅助噬菌体的制备方法参照Griffine噬菌体抗体库操作手册:辅助噬菌体M13扩增并定量稀释到1×1012 pfu/ml,分装后置4℃保存。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2.2 噬菌体抗体库的扩增和抗体库滴度测定 nbsp;nbsp;nbsp; (1) 噬菌体抗体库的扩增取100μl原库菌液，接种到100ml 2YT-AG（含100μg/ml氨苄青霉素，1%葡萄糖的2YT）培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4；加1ml辅助噬菌体KM13于25ml培养液，37℃水浴30min，4℃离心后弃上清；用50ml 2YT-AK（含100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素的2YT）重悬沉淀，37℃培养过夜；4℃离心，上清即为扩增后的噬菌体抗体库。加10ml PEG/NaCl 于上清中，冰浴1h后离心弃上清，用PBS洗涤沉淀，再重悬于含15%甘油的PBS中，-70℃保存。 nbsp;nbsp;nbsp; (2) 抗体库滴度测定取1μl浓缩后的抗体库上清，用PBS 100倍梯度稀释，每个稀释度均加入900μl 新鲜制备的大肠杆菌TG1（OD600＝0.4），37℃水浴30min后涂TYE平板，37℃培养过夜。次日计数菌落估计噬菌体抗体滴度：用噬菌体颗粒的菌落形成单位表示，pfu/ml＝集落数×稀释倍数。定量稀释到1×1012 pfu/ml保存。 nbsp;nbsp;nbsp; 1.2.3以肺癌组织中纯化的HSP70为抗原对抗体库进行四轮筛富集选nbsp; 以纯化的HSP70（10μg/ml）包被酶标板4个孔，室温放置过夜；次日用2%MPBS（含2%脱脂奶粉的PBS）室温封闭，每孔加1μl融合抗体上清和100μl 2%MPBS，室温孵育；弃上清，洗孔后，加入含胰酶的PBS 400μl 洗脱噬菌体；加200μl洗脱液于1.8ml OD600=0.