L丝氨酸的酶法合成及分析.pptxVIP

L-丝氨酸的酶法合成及分析王圆生物制药13132013040928基础知识中文名称：L-丝氨酸 外文名称： L-Serine中文别名：L-2-氨基-3-羟基丙酸分子结构：分子式:C3H7NO3分子量:105.09物性性质1. 性状：有左旋体和消旋体两种，左旋体是白色六角棱柱状晶体，味甜；消旋体是白色单斜棱柱状晶体。2. 密度（g/mL,25/4℃）：1.4153. 相对蒸汽密度（g/mL,空气=1）：未确定4. 熔点（oC）： 223～228℃(分解)5.溶解性：左旋体，溶于水，不溶于无水乙醇和乙醚；消旋体。略溶于水，不溶于无色乙醇、乙醚。主要用途1.作生化试剂和食品添加剂。2.营养增补剂，在化妆品中作为皮肤营养添加剂。3. 可供生物化学和营养学研究之用，也可作为合成环丝氨酸的原料。L-丝氨酸的合成原理本项目主要研究丝氨酸羟甲基转移酶催化甘氨酸生成L-丝氨酸。丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）在生物体内是由GlyA 基因编码的，此酶能在四氢叶酸(THF)、甲醛及磷酸吡哆醛5′-PLP 存在下，催化甘氨酸生成L-丝氨酸。其反应过程右图所示。材料、试剂、仪器：1、原料：细菌破碎上清液2、主要试剂甘氨酸、甲醛、四氢叶酸、氯化钠、葡萄糖、无水乙醇、氯化钙、氢氧化钠3、主要仪器电子天平，无菌超净工作台，高速离心机、恒温培养箱方法1、甘氨酸浓度确定：在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸至终浓度分别为6 mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L和14mmol/L，再加入甲醛至终浓度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L，37℃，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。2、甲醛浓度确定：在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入甲醛至终浓度分别为0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L和20mmol/L，再加入甘氨酸至终浓10mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L，37℃，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。3、磷酸吡哆醛浓度确定：在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入磷酸吡哆醛至终浓度分别为0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L和1mmol/L，再加入甘氨酸至终浓度10 mmol/L，甲醛至终浓度10mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L，37℃，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。4、 pH确定：在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸至终浓度为10 mmol/L，再加入甲醛至终浓度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L，并调节不同的pH为6.0,7.0,8.0,9.0,10.0，37℃，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。5、 反应时间确定：在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸至终浓度为10 mmol/L，再加入甲醛至终浓度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L，37℃，190rpm摇床反应时间分别为0h,8h,16h,24h,36h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。丝氨酸的分离与分析检测原理薄层层析是一种微量而快速的层离方法。这种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅藻土涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。本实验中硅胶作为一种固相支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在硅胶上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。材料 1．仪器薄层板：6×15cm（×2）、毛细管（×4）、烧杯50mL（×1）、药匙（×1）、量筒10mL（×1）、小尺子（×1）、层析缸（×1）、电吹风（×1）、喷雾器（×1）、烘箱（200℃）2. 试剂（1） 标准氨基酸溶液，制备下列各氨基酸的11.76mol/L(90%)异丙醇溶液各10mL。 ① 0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于11.76mol/L(90%)异丙醇溶液至10mL ② 0.01mol/L甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于11.76mol/L(90%)异丙醇溶液至10mL。 ③ 0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于11.76mol/L(90%)异丙