人ddr2基因pshuttlecmv穿梭载体的构建及表达.docVIP

人DDR2基因pShuttleCMV穿梭载体的构建及表达 nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp; 作者：任婷婷，刘新平，车红磊，张健，张璟，李霞，苏金 【摘要】nbsp; 目的：构建带有flag标签的人DDR2 pShuttleCMV载体， 检测其真核表达并观察DDR2分子的亚细胞分布. 方法：以含有人全长DDR2 cDNA的质粒为模板，用PCR方法扩增DDR2基因的C端（DDR2C），并在其C末端带上含24 bp的flag标签，Nco I/EcoR V酶切后亚克隆入含有DDR2全长序列的pMD18T载体，即替换掉原有DDR2序列的C端，引入flag标签，测序正确后再克隆入pShuttleCMV表达载体，酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染HEK293细胞，Western Blot检测DDR2flag在细胞中的表达. 瞬时转染Hela细胞，通过间接免疫荧光法观察DDR2分子在细胞内的分布情况. 结果：测序及酶切显示DDR2flag/pShuttleCMV载体构建符合预期；脂质体法转染HEK293细胞，24 h后用Western Blot方法检测到目的蛋白的表达；对转染了目的载体的细胞应用FITC标记的抗体进行间接免疫荧光实验，激光共聚焦显微镜观察到DDR2分子主要分布于细胞质与细胞膜. 结论：成功构建并表达了C末端带flag标签的DDR2真核表达载体，使其在真核细胞中表达，并观察到其亚细胞分布. 【关键词】nbsp; 聚合酶链式反应 　　0引言 　　盘状结构域受体2（discoidin domain receptor 2，DDR2）属于一种受体型蛋白酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)，可被天然纤维型胶原活化，从而介导基质金属蛋白酶（MMP1，MMP8，MMP13）的表达［1-2］. DDR2在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)成纤维样滑膜细胞中呈高表达状态，并具有较高的磷酸化水平，而其所活化的下游分子中，特别是MMP13对关节软骨的主要成分II型胶原的降解能力高于其他胶原酶，因此认为“Ⅱ型胶原DDR2MMPs”通路中的关键分子可能成为减轻RA关节软骨破坏的药物作用靶位［3］. 然而目前有关此通路的研究报道甚少，我们构建C末端融合flag标签的人DDR2基因真核表达载体，旨在为进一步研究DDR2信号通路在RA中的影响奠定基础. 　　1材料和方法 　　1．1材料大肠杆菌菌株XL10，pcDNA3.1(+)真核表达载体，含人全长DDR2 cDNA的质粒，HEK293细胞及Hela细胞由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存. dNTP，dATP，pfu高保真聚合酶，Taq DNA聚合酶，各种限制性内切酶，pMD18T载体，T4 DNA连接酶，DL2000 DNA marker（日本TaKaRa公司）；DMEM 培养基（美国Gibco公司）；Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；抗flag M2 mAb（美国Sigma公司）；抗DDR2 抗体及FITC标记的羊抗鼠第二抗体（美国Santa Cruz公司）；Western Blot所用发光底物（美国Pierce公司），其他试剂均为国产分析纯. 用于PCR反应的引物由北京三博远志生物公司合成，质粒提取和DNA回收试剂盒由安徽优晶生物工程公司提供. 　　1．2方法 　　1．2．1引物设计DDR2C上游引物序列：5′GTC ACC ATG GAC CTG CTC TCA GG3′， 其中CCA TGG为位于DDR2序列1631 bp处的Nco I 酶切位点；下游引物序列：5′GAA TTC GAT ATC TCA CTT GTC ATC ATC GTC CTT GTA ATC CTC GTC GCC TTG TTG AAG GA3′，GAA TTC为EcoR I 酶切位点，GAT ATC为EcoR V酶切位点，其中前者可用于将DDR2C（含flag）的PCR产物克隆入pMD18T载体，后者用于将带有flag标签的DDR2全长序列亚克隆入pShuttleCMV载体，下划双线部分为编码flag标签的核苷酸序列. 　　1．2．2PCR扩增DDR2C（含flag）基因及产物修饰扩增条件为94℃ 5 m