mIg免疫荧光实验例析.pptVIP

） 组员： 赵涛（1320151021） 王枭（1320151022） 黄敏（1320151023） 母利（1320151024） 王权皓（1320151025） 临床K-10班第四小组 2015年4月21日 1、掌握免疫荧光标记技术直接法的原理和操作方法； 2、熟悉荧光显微镜的使用方法。 B淋巴细胞表面携带的mIg，为B细胞特异性的表面标记，能与相应的特异性抗体结合，故可用荧光标记的抗Ig血清进行免疫荧光染色镜检。由于B细胞在分化过程中的每个阶段均具有mIg的标记 ，故该法课检出全部B淋巴细胞。每一B细胞的mIg（IgE、IgA、IgM、IgD、IgG）不同，分别可以用荧光标记的抗Ig单克隆抗体染色，则可鉴别带不同类Ig的B淋巴细胞。能与荧光标记抗体结合的细胞，在荧光显微镜下细胞膜可呈现荧光，即为mIg阳性细胞，也就是B淋巴细胞。同时用普通光源照明，计数该视野内的淋巴总数，根据发荧光和不发荧光的计数，就可以算出B细胞的百分比。 材料 1、FITC（异硫氰酸荧光素）标记的羊抗人IgM 2、受检者静脉抗凝血 3、RPMI 1640完全培养液 4、5%胎牛血清 Hank’s液 5、淋巴细胞分离液（比重1.077±0.001） 6、0.2%台盼蓝染液 7、清洁载玻片、盖玻片、血球计数板、 计数器、毛细吸管、试管、显微镜 操作流程 1、淋巴细胞分离 2、用RPMI 1640完全培养液重悬分离得到的单个核细胞，混合后计数，并用0.2%台盼蓝染液测细胞活力。用RPMI 1640完全培养液将细胞悬液配成5×10^6／mL 。 3、在试管中加入配制好的淋巴细胞悬液0.1mL ，再加入荧光抗体0.1mL ，放置4℃作用30min 4、加已经37 ℃预温的含5%胎牛血清 Hank’s液2~3mL，1500rpm离心10min,去上清液， 重复洗涤2次。 5.取沉淀细胞滴加在载玻片上，覆以盖玻片，置荧光显微镜下观察。 实验结果观察 一般先用荧光显微镜紫外光计数，继用普通光学光源计数同一视野中淋巴细胞总数。每份标本计数200个淋巴细胞，着荧光者为B淋巴细胞，计算其百分比，同时按原血标本中淋巴细胞的总数计算B淋巴细胞的绝对值。 免疫荧光染色细胞的形态和类型：凡呈现微弱，均匀一致的暗淡荧光者为非B细胞；凡细胞呈现较强荧光，有明显的细胞轮廓，并可见环状或两个以上斑点或在细胞的一侧见有帽状结构的为B细胞 正常人外周血中mIg阳性细胞均值±SD为11.2%±1.5% 1、每次实验前荧光抗体需3000rpm离心30min,以除去荧光血清中的聚合蛋白 2、荧光抗体与细胞孵育时应在4℃或冰上，避免非特异性结合。 3、细胞形态的观察具有一定的主观性，需仔细判断。