微生物学遗传育种实验培养基的配制.docVIP

3. 牛肉膏蛋白胨培养基NA3（培养细菌用） 牛肉膏 5g 蛋白胨? ??? 10g 酵母浸膏 1g 蔗糖 10g 琼脂 15~20g pH? ? 7.0-7.2 水? ?? ?? ?? ??? 1000mL ? ???121℃灭菌20min。 牛肉膏作用：提供维生素A\B\C，氮源、碳源等。蛋白胨作用：提供碳源、氮源、生长因子。加琼脂可观察细菌菌落状况。培养基斜面搁置为了扩大接种面积。 第一天：2010年9月11日 星期六 上午9：00-12：00 配培养基，灭菌，做斜面，倒平板，制备菌悬液，涂布，培养 第二天：2009年9月12日 星期日/星期一 下午14：00-16：00 挑选20-30个有水解圈的菌落到平板（平行2个）； 第三天：2009年9月13日 星期一/二 下午14：00-16：00 挑取3-4个水解圈最大的目标菌落接到斜面保种（每个菌落平行两个保种） 准备（每一组）： 1、酪蛋白培养基 （200ml; 100ml/bottle; 2瓶）每组要倒10个酪蛋白平板； 2、牛肉膏蛋白胨斜面 （50ml; 分装10支试管） 3、稀释用灭菌水 （4.5ml dH2O /管，5支试管） 4、制备土壤悬液用水 （45ml dH2O，玻璃珠若干; 1瓶） 实验步骤： 采集土样 培养基 1.1 斜面培养基（自己计算50ml所需的量，也可以几个组一起配）: 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g， H2O 1000ml，pH值7.0,琼脂粉15g 1.2 分离培养基（自己计算200ml所需的量，也可以几个组一起配）：酪蛋白培养基: 酪素5g （先用0.2N的NaOH充分溶解），牛肉膏3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl 10.0g，pH7.0～7.5，H2O 定容至1000ml,琼脂粉15.0g，分装2瓶灭菌 112℃， 30min。 清洗包扎灭菌 清洗包扎：平皿，移液管，三角瓶 配制稀释用无菌水和土壤悬液用水：5支，每支试管中加入4.5ml蒸馏水，塞上试管塞，包扎；取6-8颗玻璃珠加入到装有45ml水的三角瓶中，包扎灭菌 配制并分装培养基 (1) 斜面培养基：10支试管(5ml/支） (2) 分离培养基：10平皿（20ml/皿） 灭菌：112 ℃，30min 振荡培养 待水放凉，取土样5g加入到装有45ml无菌水的三角瓶（6-8颗玻璃珠）中，37 ℃震荡培养15min。 纯种分离 (1) 制作平板 (2) 稀释富集培养液至10-3,10-4,10-5 (3) 涂布：吸取0.1ml以上三个稀释度菌液，用无菌涂布棒均匀涂布，在平板上标记记号（即每组涂三个）。 培养：吹干，倒置平皿，37℃培养 。 观察：第二天或者第三天观察菌落周围是否出现透明圈。 筛选：取另两个分离培养基平板，用记号笔划分为20-30个方格，将出现较大透明圈的菌落分别平行挑接至两个平板对应位置的方格内，标记好记号，37 ℃培养24或48hr。 进一步鉴定，取一个平板向平板内菌落间加入少许10%三氯醋酸，过片刻再观察，找出出现较大的明显水解圈，对照另一个平板找出对应的菌落。 划线：挑出6-8个菌落在剩余的分离培养基平板上划线，每板平分，分别挑两个菌落单独划线。 挑取确认的单克隆在斜面培养基上划线保种 实验材料 (一) 菌种枯草芽孢杆菌株 (二) 培养基(见附录)(1) 完全培养基(CM，20ml液体)：蛋白胨 1 g ， 葡萄糖 1 g，酵母粉 0.5 g，牛肉膏 0.5 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水 100 mL， pH 7.2 。(2) 完全培养基(CM，120 ml固体、6个平板) 液体培养基中加入2.0%琼脂； 这个各组要先配，因为马上要用，各组可以自由结合一起配，按每组150ml，然后分装一瓶20，一瓶130，加入2.6g琼脂。 各组至少12:00之前一定要接种，摇床摇2-3个小时，下午要用。 前面做好灭菌后再做后面：(3)高渗再生培养基(CMR,100ml,3-5个平板)：蛋白胨 1 g，葡萄糖 1 g，酵母粉 0.5 g，牛肉膏 0.5 g， NaCl 0.5 g，蔗糖 0.5 mol/L(17.1g)， MgCl2 20 mmol/L(0.19g)，琼脂 2 g，pH 7.0 ， 灭菌20 min。 （4） 液体发酵培养基（100ml）： 牛肉膏0.3g，蛋白胨 1.0g，NaCl 1.0g，pH自然，H2O 定容至100ml. 分装两个三角瓶，每瓶50ml。 (三) 缓冲液 (1) 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0)，100ml 磷