脑神经系统-神经解剖学研究方法幻灯片.pptVIP

神经解剖学的研究方法 一、传统的研究方法 二、近代的研究方法 * （一）大体研究方法： 显示脑血管、主要核团和纤维束、脑室等。塑化标本用于断 面解剖学。 （二）组织学研究方法： 固定、切片、染色 1.H.E染色 2. 硝酸盐镀染：机制不清(显示神经元轮廓和突起的行向)。 3. Nissl法：碱性染料---核酸结合(焦油紫、甲苯胺蓝、培花青等)。 （一）组织化学的研究方法： 生化学+组织学：固定良好，称量准确，器皿洁净，严格操作。 1. 酶组化：底物 (有色)原位沉淀 四氮唑盐或金属(铅、钴、铜) (1)胆碱能神经元的检测：乙酰硫胆碱 硫胆碱 铁氰化物 亚铁氰化物 (2)NO能神经元的检测： β还原辅酶A 蓝色沉淀 硝基四氮唑蓝 酶 AchE Cu 棕色沉淀 ++ (黄递酶) NOS （二）荧光组化(Fluorescence Histochemistry) 自发荧光和诱发荧光： 紫外光 标本 激发滤片 物镜 吸收滤片 目镜 1. 单胺荧光组化： (1)甲醛诱发荧光： (2)乙醛酸诱发荧光：CA 四氢异喹啉 双氢异喹啉 5HT 四氢β-咔啉 二氢β-咔啉 FAorGA 蛋白 催化 H+ (绿色荧光) FAorGA 蛋白 催化 H+ (黄色荧光) (三)免疫组化(Immunohistochemistry) 1.原理：抗原抗体反应。 重链 N端 可变区 抗体活性部分 Fab段 轻链 C端 稳定区 抗原决定簇 Fc段 C端 Fc Fab N端 重链 轻链 C区 V区 C区 抗原 第一抗体 F 标记物 直接法 抗原 第一抗体 间接法 第二抗体 F 标记物 2. PAP法的原理 注意事项： 1)一抗的特异性要强，效价要高。 2)二抗的量要足(双桥PAP法)。 3)PAP复合体与一抗来自同一动物种属。 4)要设对照试验(吸收试验、置换试验、交叉试验)。 5)提高染色质量的措施：H2O2甲醇液—去内源性HRP；Triton X-100—增加通透性；酶消化，微波—重新释放抗原。 (四)免疫荧光组化 基本原理：显示标记物改酶标为荧光素(异硫氰酸荧光素 FITC、四甲基异硫氰酸罗达明TRITC)，在荧 光显微镜下观察。 A B 直接(A)和间接(B)免疫荧光法原理示意图 (五)亲合免疫组织化学 1. 原理：是利用两种物质之间的高度亲和力与免疫反应结合 起来的技术。 这些物质包括：植物凝集素与糖类，生物素与亲合素，葡萄球菌A蛋白与IgG，阳离子与阴离子，激素与受体。 2. ABC法的原理(Avidin Biotin-peroeidase Complex) 亲合素—生物素过氧化物酶复合体 3. ABC法的优点： (1)灵敏度高； (2)非特异性着色较少； (3)使用和操作较简便。 4. SABC法的原理(Strept Avidin Biotin-enzyme Complex): 链酶亲合素—生物素—酶复合物 — 非特异性染色++ (与人源性凝集素样蛋白质结合；与细胞膜、核起反应) 等电点不高 (6~6.5) 等电点高 (10~10.5) 不含糖链 分子中含寡糖 链酶亲合素 亲合素 (六)原位杂交组化技术 (in-Situ hybridization histochemistry, ISHH) 1.