細胞活力的测定.docxVIP

/bbs/thread/36127#36127细胞污染的分析/st118460/Article_376526.html/st118460/Article_376526.html淋巴细胞完全培养液的成分皮肤成纤维细胞和THP-1[indent]细胞：皮肤成纤维细胞是贴壁生长的。THP-1细胞是悬浮的。由于我们实验室养细胞的时间也不是很长，所以也只能说说自己平时的操作了。 先说皮肤成纤维细胞。当细胞铺满瓶底，也就是细胞与细胞之间没有间隙时，就可以传代了。一般十天左右传一代。先吸弃旧培养液，用D-Hanks液洗两遍，再 加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后静置两分钟左右，最好是能在显微镜下观察，当细胞之间出现间 隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。吸去胰酶，加入含血清培养液，摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。因为血清可以终止胰酶的消化。然后吹打瓶底各处使细胞脱 落。再分瓶补加培养液。 THP-1细胞的传代就比较简单了。可以有两种传代方法。如果镜下观察细胞状态很好，没有其它杂质即细胞裂解物之类的，就 可以采用直接传代法。传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。吸弃上层少量培养液约三分之一，将余下的培养液分成两瓶，再分别补加培养液即可。 如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。如果细胞数目较多可以低速离心约600转离心六分钟，细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类的杂 质。如果觉得细胞数目不多比较宝贵，那就提高转速可以1000转离心六分钟，这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。离心后去除上清液，加入新 的培养液吹打浑匀即可分瓶传代了。目前的方法就这些，希望对新手有所帮助[/indent] THP-1 细胞是悬浮细胞，相对贴壁细胞要求高一点。细胞养不好，可能的原因有，THP-1细胞特别依赖细胞浓度，ATCC上10 5到106每ML，是一个很高的密度，细胞少了就不太容易养好。1、细胞株的来源很重要，如直接来源于ATCC（American Type Culture Collection 美国模式菌种保藏中心）生命力要强于国内细胞库的2、注意细胞的密度一定要高，介于5×105—— 106/ML之间，增值的快。细胞数量太少，不适合THP-1生长，一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多，继续培养一天或者两天，培养基 严重泛黄，细胞数量会巨增。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。3、THP-1细胞适合在细胞ph环境偏酸环境生长，对培养基变化非常敏感，所以 尽量使用相同ph的1640，4、还要注意，传代后切忌常移出培养箱观察，否则会影响细胞生长，状态变差，一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般THP-1 生长相当快，对于状态已经不好的情况，建议传代后3～4天再观察，一般4天时间培养基已明显泛黄，细胞数量巨增。1)THP-1细胞喜欢酸性条件，你不要 老是换培养基。越酸的条件，细胞密度越大，细胞就长得越好。2） 不要频繁换液，一般2-3次换液离心一次（只是补充培养基）3） 使用1640（ATCC推荐），注意加碳酸氢钠2.5g就可以了，宁酸勿碱 4） 注意冻存的时候密度大些，推荐用血清冻存5）感觉Hyclone的血清比较好6）复苏比较慢，建议开始用小瓶，不要用一次性的\聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞?【试剂及配制】（1） 聚蔗糖-泛影葡胺分层液：有成品供应，比重为1.077±0.0001。（2） 台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml，1500r/min 离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。（3） HBSS或RPMI-1640液【操作方法】（1） 采集静脉血若干ml(随需要而定),注入盛有肝素的无菌小瓶中(每1ml全血用0.1ml 125～250U/ml肝素溶液抗凝),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝；（2） 用吸管加入等体积的室温HBSS或PBS,使血液等倍稀释,可降低红细胞的凝聚,提高分离效果（此步骤亦可省去）；（3） 吸取淋巴细胞分层液(每10ml稀释血加5ml分层液)置于15ml或50ml离心管中,然后将离心管倾斜45°角,将稀释血液在距分层液界面上1cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面(亦可将吸管嘴插入离心管底部,将分层液缓慢加在稀释血液的下面),应注意保持两者界面清晰,勿使血液混入分层液内；（4） 将离心管置水平式离心机内,在18℃～20℃下,以2，000r/min离心20min。离心后,管内可分为以下四层:上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细