細胞生物学,细胞培养.docVIP

本科学生综合性实验报告 学号 094120008 姓名 范静宇 学院 生命科学学院 专业、班级 生物科学09级生科A班 实验课程名称 细胞生物学实验 教师及职称 周滔 （实验师） 开课学期 2011 至 2012 学年 第一 学期 填报时间 2011 年 11 月 24 日 云南师范大学教务处编印 实验序号 实验五 实验名称 人类淋巴细胞株培养 实验时间 2011年10月31日，11月7日，11月14日，11月21日 实验室 一.实验目的 （一）、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌） 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 （二）、培养基的配制 熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。 （三）、细胞传代培养 熟练掌握细胞传代培养的操作方法。 观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。 （四）、死活细胞的鉴别 掌握死活细胞的鉴别原理及方法。 二、实验原理、实验流程或装置示意图 实验原理： 体外培养，就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 2.体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。 3.灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。 （二）、培养基的配制 1.细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。 2、小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。 3. 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。 （三）、细胞传代培养 1.悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。 2.悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。 （四）、死活细胞的鉴别 细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。原理：许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来区别死活细胞。 三、实验仪器、材料和试剂 （一）仪器 超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、高压灭菌锅、多重蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、微量加样器、倒置显微镜、光学显微镜、蒸馏水器、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、 微孔滤膜（直径25mm）：孔径为0.22um0.22μm）及注射器、各种规格的Tip 、离心管、细胞培养瓶、pH试纸、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸、血球计数板、滴管、培养细胞、人类淋巴细胞株 (三试剂 75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、 HCl等NaHCO3 、L-谷氨酰胺、三蒸水、台盼蓝（染料）、乙醇、0.4%台盼蓝溶液 （一）、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌） 清洗：1.新玻璃器皿的清洗 5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和 2.使用过的玻璃器皿的清洗 1）立