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细胞培养实验写报告内容 1目的 2 原理 3材料与方法（操作步骤） 4实验结果 5结论或结果分析 实验一 鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养 实验二 滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养） 实验三 Hep-2细胞的传代培养 实验四 VSV TCID50滴定 实验五 干扰素活性（效价）的测定 实验六 VSV中和试验（稀释血清固定病毒法） 实验二 鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养 一、目的 1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤； 2、掌握活细胞的显微镜下观察； 3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。 二、原理 离体动物组织通过温和的手段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养条件，能生存、生长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，比如肌肉细胞的收缩功能；上皮细胞的分泌功能等。通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期称为原(初)代培养。原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等的研究。 三、材料（按2人/组的量发放） 名 称 数 量 备 注 9～11日龄鸡胚 1只 无菌器械 1套 无菌无毒平皿 2只 5或10ml吸管 4支 1或5ml吸管 1支 青霉素瓶（带塞） 2只 Hank s’ 液 250ml 1640 RMPI或DMEM 500ml 双抗 5ml 胰蛋白酶 1ml 小牛血清 5ml 5.6% NaHCO3 3ml 碘酒和酒精棉球 若干 细胞培养瓶 2只 四、操作步骤 1、在DMEM和Hank’s 液中分别无菌操作以1％的量加入双抗，吸出10～15mlHank’s 液至无菌平皿中备用； 2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳； 3、取出两只无菌平皿，并标记①和②，待用。 4、大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳； 5、消毒镊子后小心撕破卵膜，两人互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平皿①中，小心去头、内脏、爪和粘液及血球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平皿②中，再充分洗涤； 6、取出洗净的组织块置于大青霉素瓶中，在火焰附近用无菌眼科剪刀将其剪成约0.5～1mm3的小块（约250次），此时体积约0.5ml；用Hank s’ 液洗涤两次。 7、按照10倍量加入0.25％胰蛋白酶，调节pH至约7.3～8.0（肉眼观为肉红色）盖上瓶塞，写好标记； 8、将上述细胞瓶置于37℃水浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。消化停止的标志是：轻轻晃动后细胞悬起，呈云雾状，很快聚集成团，表明细胞活力好。 9、消化结束后，取出，稍沉淀，缓慢吸出上清，用Hank’s 液小心洗涤2～3次，可以尽量减少胰蛋白酶的残留量，然后加入DMEM液约5ml，用小头吸管充分吹打，使细胞充分分散。吸上清；重复操作3～4次，收集细胞上清。 10、（1）上述细胞悬液自然沉降，待未消化彻底的组织块沉入瓶底后，收集上清，并加入足量的小牛血清（终浓度为10％），将细胞密度调到约1×106个/ml。 （2）经四层无菌纱布过滤后收集滤液，并加入足量的小牛血清（终浓度为10％），将细胞密度调到约1×106个/ml； 11、将上述制备好的细胞悬液平均分配到2只细胞瓶中，5ml/瓶，塞好螺口塞，注意生长面朝下，在非生长面上做好标记，包括细胞名称，接种培养时间，组别及姓名等。 12、细胞统一置于本室指定的CO2孵箱中培养。 13、24h后观察细胞生长情况，如果细胞长成单层，细胞界限清晰，大多数细胞为梭形并贴壁，布满细胞瓶的生长面，说明细胞生长状态良好。 实验三 滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养） 一、实验目的 掌握病毒在细胞内增殖的基本判断方法。 二、实验原理 原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等研究。 病毒在细胞内增殖的检测指标有细胞变化、红细胞吸附、细胞代谢改变、干扰现象、免疫荧光法检测等。由病毒引起的细胞病变称细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），常见的细胞形态学变化为细胞变圆、聚集、融合、裂解或脱落等。 三、实验材料（按2人/组的量发放） 名 称 数 量