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细胞生物室操作规范 细胞培养室是对各种动物组织细胞进行体外培养的实验室，具有 良好的空气净化系统及多种大型精密仪器。为保证实验室的正常工作秩序，请做到以下几点： 1.每天工作前打开换气扇及紫外灯半小时，确保无菌环境。 2.进入操作间要换洁净的白大衣、拖鞋，清洗双手。 3.操作间地面每周以新洁尔灭清洁两次。 4.CO2培养箱每月以70%酒精清洁一次；注意CO2浓度，及时更换气瓶。 5.倒置、荧光显微镜及附设照相、图象采集分析系统的使用必须在专管人员指导下，严格按操作规程进行。 6.培养的细胞要定期观察及时换液，做好记录，遇有污染，彻底消毒。 7.操作完毕，认真清洁超净工作台。 8.离开实验室前关闭各水、电闸门。 各种培养用液的配制 一、平衡盐溶液（BBS）的配制 Hanks液 按成分表所示，准确称量试剂；许多试剂是含有水分的化合物，与不含水分者的称量不同，应加以换算； 将CaCl2先溶解于100ml水中； 其它成分依次溶解于750ml水中（注意应待前一种试剂完全溶解后，再溶解下一种成）； 用数滴5.6%的NaCO3溶液溶解酚红； 将2缓慢倒入3中，并不时搅动，防止出现沉淀； 将4加入5中； 将6入容量瓶中，补足水充分混均； 分装瓶中，8磅10分钟高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存。 二、培养液的制备 用干粉制备培养液的制备 制备出去离子水（玻璃三蒸水）； 加温水至15-30℃； 把干粉加入水中，搅拌令之溶解； 加NaHCO3； 加水至最终量； 必要时用1HCl或1N NaOH调节pH；因滤过时pH可能受影响； 用0.22μm滤膜滤过消毒。 三、胰蛋白酶溶液的配制 (1)将D-Han液高压消灭菌，用NaHCO3液调节PH至7．2左右； (2)称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐 溶液，搅拌混匀，量室温4小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡； (3)次日先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25％或0.125%，胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调PH至7．2左右。 星形胶质细胞的原代培养 药品和试剂 　　DMEM(Gibco) 培养基，添加10%胎牛血清(Hyclone)、4mmol/L-谷氨酞胺(Sigma)、10万U青霉素、10万U链霉素、15mmo/L HEPES(Sigma)；0.25%、0.1%胰蛋白酶、75%酒精。 仪器设备与材料 无菌手术器械、超净台、医用离心机、空气浴振荡器、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、细胞培养瓶、75μm筛网、细胞计数器、吸管等。 三、实验对象 Wistar大鼠(天津药物研究院提供) 四、操作步骤 1、出生后2d内Wistar大鼠(天津药物研究院提供)，无菌条件下断 头处死，取脑，投入D—Hsnk‘s平衡盐溶液中，去除中脑、脑脊膜及大血管．皮层剪碎成l一2mm3小块，吸管吹打1min； 2、0．25％胰蛋白酶消化10min； 3、1500r／min离心10min，收集沉淀，DMEM重悬； 4、75μm筛网过筛．滤液1500r／min离心10 min，收集沉淀，以培养液重悬，调整细胞至1×106个/毫升。接种于75cm3培养瓶、5%Co2，95%空气，37℃饱和湿度培养。 5、4h后换液，弃掉非贴壁细胞。 6、5d后将培养瓶置于水平摇床，160 r/min，2h，37℃，换液弃除小胶质细胞，恢复1h后．重新置于水平摇床、160 r/min,18h,37℃,换液弃除少突胶质细胞。 2d后以胰蛋白酶0.1%,8min)消化、传代培养，待细胞长至近80%融合时用于实验。 脑皮层神经元的原代培养 一、药品和试剂 　　DMEM(Gibco) 培养基，添加15％FCS(Hyclone)、4mmol/L。L—谷氨酰胺、10万U青霉素、10万U链霉素、15mmol/LHEPES；0．2％胰蛋白酶／0．02％EDTA、2×10-5mol/L阿糖胞苷、75%酒精。 仪器设备与材料 无菌手术器械、解剖显微镜、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、细胞培养板、75μm筛网、细胞计数器、吸管等。 三、实验动物：16d龄Wi star大鼠 四、操作步骤 无菌条件下。取16d龄Wi star大鼠胚胎脑，置于含7.5mmol/L葡萄糖的DMEM中，解剖显微镜下去除嗅球、脑脊膜、海马和基底核、将皮质剪碎成1mm3小块； 吸除DMEM，0．2％胰蛋白酶／0．02％EDTA消化1min，10%FCS终止消化，1000 r/min离心10 min； 用培养液重悬沉淀,75μm筛网过筛，调整细胞密度至1.0×106个/毫升。接种于预先涂有0.005％多聚赖氨酸(ploy—L—lysine、Sigma)的培养板中、5％Co2、