蛋白质工程设计幻灯片.pptVIP

小组成员：雷文丽 李亚 刘苗 在分子设计的实践中，常依据改造部位的多少将分子设计分为三类： 1．定点突变或化学修饰法（小改） 置换、删除或插入氨基酸，依赖分子生物技术，是目前最广泛使用的方法 2．拼接组装设计法（中改） 当前主要从基因水平上完成，又称“分子裁剪” 3．从头设计全新蛋白质（大改） 从基因水平上，或直接进行化学全合成 蛋白质从头设计概念 从头设计：根据生物分子的活性位点特征产生一系列的结构片段，通过连接这些结构片段可以构成一个全新分子；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。 蛋白质结构的设计 1、二级结构模块单元的自组装 2、配体诱导自组装 3、通过共价交叉连接实肽的自组装 4、在合成模板上肽的自组装 5、线性多肽折叠为球状结构 6、基于基因库的全新蛋白质设计 ２．键合及催化的从头设计 23个氨基酸自动折叠成的锌指结构（ββα5）的核磁共振（NMR）结构(Struthers et al., 1996, 1998)； ββα5同源四聚体衍生物ββαT2的X-射线结构（Ali et al., 2004)； ββαT2异源四聚体衍生物ββαhetT1的X-射线结构 (Ali et al., 2005). 结构域替换 寡聚化策略 异源专一性 的计算机重 新设计 ββα型异源四聚体的设计历程 ３．在全新蛋白质中引入结合位点 全新蛋白质设计除了能折叠为预想的结构外，还要设计新的结合位点（金属位点、血红素结合位点等）及催化性质。 新的金属结合位点 ４．催化活性蛋白质的设计 这类设计的早期代表性工作是Chymohelizyme及Helichrome。两个设计蛋白质的催化位点与天然酶类似，在Chymohelizyme中设计的活性位点，是模拟胰凝乳蛋白酶在Helichrome中的卟啉环类似于血红素蛋白的活性位点。两个设计均使用人工交叉连接预组织结构并使活性口袋的位置接近催化活性部分。 后来又设计了人工脱羧酶（ART-OAD） 放置一个赖氨酸在两亲螺旋极面上并非常接近其他赖氨酸链，使中心的赖氨酸作亲核试剂，支架上的赖氨酸是荷正电能与荷负电的底物成键。CD谱以及NMR谱研究表明，α螺旋占优势。它的二级结构依赖于浓度，表明两亲螺旋的组装体为期望的多聚体（可能是四聚体）。它的Km（14mmol/L)类似于天然酶（Km=4mmol/L)。合成肽的Kcat（0.4min―1）比天然酶慢5个数量级但仍比脱羧反应快900倍。 5、膜蛋白及离子通道的设计 一个全新膜蛋白从一个不溶于水的聚集体转化为类似于膜的环境要求构象变化。 Montal等设计了一系列模拟天然离子通道特征的全新蛋白质，这些合成的微孔蛋白质称为Synporin，是使用Mntter的模板模拟方法。4条相同的23肽α螺旋被固定在载体模板上，并且相互平行。 Synporin结构 CD谱研究结果表明，101个残基的Synporin主要是α螺旋。形成的离子通道具有如下特点：单通道；能区别不同的阳离子；在毫秒时间范围内打开与关闭；对局部麻醉通道阻塞剂是敏感的。 Lear等设计并合成了含有简单两亲α螺旋的离子通道，其具有的特点是：序列与天然离子通道序列不同；不用模板，是通过自组装形成围绕一个中心亲水孔的多聚体。 * * * * * * 蛋白质工程 第三节 天然蛋白质的剪裁 第四节 全新蛋白质设计 第三节 天然蛋白质的剪裁 分子剪裁：指在对天然蛋白质的改造中替换1个肽段或1个结构域。 方法： 1、将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上 2、将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。 应用 1、嵌合抗体 利用基因工程的方法对鼠源单克隆抗体进行改造使其人源化，鼠源抗体的V区与人源抗体的C区进行拼接形成人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原型； 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。 2、人改型抗体 将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区。 结构与功能的容忍度 ⊙ 蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度 ⊙ Fersht等替换了Barnase的所