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显微技术(Ⅰ光镜) 江苏大学 基础医学与医学技术学院 组织胚胎学系 卢小东 分辨率： 光镜：0.2 μm 电镜：0.1nm 显微镜技术: 光镜：light microscopic, LM 电镜：electronic microscopic, EM 透射电镜（transmission electron microscope, TEM）：观察细胞内部结构 扫描电镜（scanning electron microscope, SEM)：观察组织或细胞表面的立体结构 细胞培养 特点：石蜡切片是使石蜡充分浸入组织，组织块变硬，有利于切薄，制作的切片能完好地保存组织原有的结构，透明度好，并可长期保存，有利于显微镜下观察组织图像。这种方法包括以下几个步骤：  取材 根据教学和科研的具体要求确定材料、部位和方法 材料新鲜 组织块的大小：使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部。如制作病理外检、科研切片，取0.1～0.2cm即可 勿挤压组织块 保持组织原有形态、保持组织清洁 ?固定 ????为了阻止组织细胞的死亡后变化，防止自溶与腐败，保持组织内细胞原有的形态结构，切取组织块后应立即进入固定液，常用的固定方法有： ?小块组织固定法：标本：固定液为1：4～20；最常用的方法，但组织块不易过大过厚，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间适当延长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。 注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管，经血管分支达整个组织和全身，从而得到充分的固定的目的。 固定液：单纯固定液（10%甲醛固定液和95`%乙醇） 混合固定液： 酒精 -甲醛固定液（ 95%酒精9份、40%的甲醛1份）； Zenken氏液（重铬酸钾2.5g，升汞5.0g，蒸馏水100ml,冰醋酸5 ml）； Bouin氏液（苦味酸饱和水溶液25 ml,40%甲醛25 ml，冰醋酸5 ml）  浸蜡 已透明的组织移入已熔化的石蜡中，使蜡充分浸入组织内，此过程称为浸蜡又称透蜡。浸蜡时应注意以下几点： 浸蜡熔点：石蜡分为软石蜡与硬石蜡两种，熔点为42～54℃一般称为软蜡，熔点为56～62℃称为硬蜡。浸蜡时，应先经软蜡再经硬蜡，（常用的浸蜡熔点为52～54℃、54～56℃、56～58℃Ⅲ级浸蜡），使组织中含有的透明剂完全去尽。 浸蜡温度：浸蜡的温度应高于熔点的2～5℃为宜，温度过高可致组织过度收缩或变脆，如在温箱内浸蜡，要将温度控制在60～65℃的范围。 浸蜡时间： 可根据组织块的大小及其组织种类而定。30min~几小时  包埋： 将浸蜡后的组织置于融化石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中，称蜡块，此过程称为包埋。包埋用的石蜡和加温的镊子均不能温度过高，防止组织被烫伤，破坏组织结构。包埋用的石蜡温度应与组织块本身的温度相等，如温度不一，可造成组织与周围石蜡脱裂的现象。包埋所用的石蜡要求无杂质，并有一定的粘韧性。蜡的熔点与组织块相适应，过硬的组织（如骨组织、肌肉组织、皮肤等）可用硬度较高的石蜡包埋。包埋用的石蜡可以重复使用， 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法：低温恒冷箱冰冻切片法 取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。 冰冻切片染色 　　① 切片固定30秒－1分钟。 　　② 水洗