原核基因表达调控模式2fjy.pptVIP

α-互补 蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。 用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因，lacz中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。 操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 二 转录水平上的其他调控 The holoenzyme (complete enzyme) is the complex of five subunits including core enzyme (α2ββ and σ). The core enzyme is the complex of RNA polymerase subunits that undertakes elongation. It does not include additional subunits or factors that may needed for initiation or termination. Sigma factor is the subunit of bacterial RNA polymerase needed for initiation; it is the major influence on selection of promoters. 1、σ因子的更换 在E.coli中,当细胞从基本的转录机制转入各种特定基因表达时，需要不同的?因子指导RNA聚合酶与各种启动子结合。 作用机制：?因子结合在调控基因上游的不同区域（如启动子），主要参与双链DNA解开为单链，从而选择模板链和转录的起始。 大肠杆菌中的各种σ因子比较 σ因子 编码基因 主要功能 σ70 rpoD 参与对数生长期和大多数碳代谢过程基因的调控 σ54 rpoN 参与多数氮源利用基因的调控 σ38 rpoH 分裂间期特异基因的表达调控 σ32 rpoS 热休克基因的表达调控 σ28 rpoF 鞭毛趋化相关基因的表达调控 σ24 rpoE 过度热休克基因的表达调控 温度较高,诱导产生各种热休克蛋白 由σ32参与构成的RNA聚合酶与热休克应答基因启动子结合，诱导产生大量的热休克蛋白，适应环境需要。 枯草芽孢杆菌芽孢形成 有序的σ因子的替换，RNA聚合酶识别不同基因的启动子，使芽孢形成有关的基因有序地表达。 3、弱化子对基因活性的影响 当操纵子被阻碍，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的一段核甘酸被称为弱化子。起信号作用的是有特殊负载的氨酰-tRNA的浓度。 微调？ 4、细菌的应急反应 应急反应信号是鸟甘酸四磷酸（ppGpp）和鸟甘酸五磷酸（pppGpp）。 当氨基酸缺乏时，空载tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，而ppGpp将关闭许多基因，同时也将打开一些合成氨基酸的基因，以应付紧急情况。 ppGpp作用机制： （1）RNA聚合酶有不同的构象，可以识别不同的启动子区，ppGpp与RNA聚合酶结合会使它的构象稳定下来，从而改变了基因转录的效率。 （2）基因转录起始位点附近有一些保守序列可能是ppGpp或有关调节蛋白的结合位点；当这些序列与ppGpp结合后，就不能与RNA聚合酶结合，基因关闭。 一、翻译起始的调控 RBS（核糖体结合位点）：mR