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雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质研究 摘要：采用同源克隆法获得了雪白根霉的脂肪酶基因（rnl），将其连接到pPICZαA载体上，得到重组表达载体pPICZαA- rnl。将表达载体pPICZαA- rnl用限制性内切酶SacI线性化后，电击转入毕赤酵母X-33中。雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母X-33中成功表达，重组菌株摇瓶培养144 h后，酶活可达48 U/mL。重组酶最适pH值为8.5，最适反应温度为35 ℃。1 mmol/L的Mn2+, Ca2+ 和K+ 以及1%的表面活性剂吐温20，吐温80，曲通100对重组脂肪酶具有激活作用。重组酶的最适底物为三月桂酸甘油酯（C12）。 关键词： 雪白根霉，脂肪酶，毕赤酵母X-33 脂肪酶（Lipase，E.C.3.1.1.3），全称为三酰基甘油酰水解酶（triacylglycerol acylhydrolase），它属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶可以在油水界面上催化天然底物油脂水解,释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸，而在非水相体系中脂肪酶还可催化转酯和酯合成等多种反应[1]。 脂肪酶作为一种重要的工业酶被广泛的应用到食品加工、洗涤、医药等领域。脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中，相对于动植物，微生物分泌的脂肪酶具有很多的优势：如微生物分泌的脂肪酶一般都为胞外酶，更适合工业化大生产；微生物来源的脂肪酶具有更广的作用温度范围、作用pH以及底物专一性[2-3]。随着国内外对脂肪酶研究的深入，越来越多的微生物脂肪酶被发掘出来。微生物脂肪酶主要分为细菌脂肪酶和真菌脂肪酶两大类，细菌脂肪酶研究较多的是假单胞菌属脂肪酶[4]，真菌脂肪酶的研究主要集中在根霉属和酵母属两大类[5-6]。相对于其他微生物来源的脂肪酶，根霉属脂肪酶具有高度的1、3位置专一性和立体选择性。在根霉脂肪酶中，来源于米根霉的脂肪酶被广泛应用于生物柴油的生产[7-8]；来源于华根霉的脂肪酶主要应用于烘焙食品、有机合成等领域[9-10] ；相对于以上两种根霉脂肪酶，雪白根霉脂肪酶主要应用于油脂加工、改性等领域[11-12]。为了进一步提高雪白根霉脂肪酶（RNL）的酶活及改善其酶学性质，许多学者开始应用分子生物学的方法研究其脂肪酶基因的克隆、表达、调控等。迄今，雪白根霉脂肪酶基因已经在酿酒酵母中实现了异源表达[13]。相对于酿酒酵母表达系统，毕赤酵母表达系统具有更多的优势：培养条件简单、易于操作便于工业化生产；高稳定性表达，可高效的表达外源蛋白等[14]。到目前为止，还没有关于雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母进行表达的研究报道。本研究首次将雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中进行了异源表达并且测定了重组雪白根霉脂肪酶（RNL）的酶学性质，为下一步对雪白根霉脂肪酶基因进行基因改造以及高密度发酵重组雪白根霉脂肪酶酵母工程菌奠定基础。 1.材料与方法 1.1 材料与试剂 表达载体pPICZαA、毕赤酵母X-33，博莱霉素，购自美国Invitrogen公司。大肠杆菌Top10 ，高保真Pfu酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoRI、XbaI、质粒提取试剂盒、真菌基因组提取试剂盒、PCR纯化试剂，购自上海生工公司；不同碳链长度的脂肪酶底物，购自美国Sigma公司；其他常规试剂均为国产分析纯或进口分装；引物由深圳华大基因合成。大肠杆菌用LB培养基进行培养，酵母转化子分别用YPDZ和罗丹明B培养基进行筛选，酵母摇瓶培养及产酶培养基分别为BMGY和BMMY。 LB、YPDZ、BMGY和BMMY培养基分别参照Invitrogen公司的酵母表达手册进行配置。罗丹明B培养基的配方为：在YPD培养基的基础上加入2×10-4 %（w/v）的罗丹明B和1%（v/v）的橄榄油。 1.2 仪器与设备 PCR仪、凝胶成像系统、冷冻离心机，珠海黑马科技有限公司； 电穿孔仪， 美国Bio-Rad 公司；脂肪酶活性测定酸碱滴定仪，瑞士Metrohm公司； 1.3雪白根霉脂肪酶基因克隆及表达载体的构建 1.3.1 雪白根霉基因组DNA的提取 挑取雪白根霉菌丝体，接入50 mL PDA液体培养基中，30 ℃，200 r/min 培养3天，离心取菌体，参照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。用微量紫外分光光度计测定DNA的浓度，选取A260/A280值在1.8~2.0的样品于-20 ℃保存备用。 1.3.2 雪白根霉脂肪酶基因克隆 据文献报道[13]，雪白根霉的脂肪酶基因不含有内含子，因此可以以雪白根霉的基因组DNA为模板，通过PCR的方法扩增rnl。 经过分析NCBI上已报道的rnl的全基因组DNA序列（Genebank登录号为：AB013496），设计了一对引物，上游引物：5- CAGCGAATTCATGGTTTCATTC