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分数：序号：免疫学读书工程指导教师：金涛姓名：屈旭成学号：业： 制药工程班级：制药一班年级： 2012学期： 2014-2015第一学期《免疫细胞化学和分子病理学技术》读书报告-免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学是免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）中最常用的方法之一。它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质（抗原／抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术。在20世纪90年代免疫组织化学有了重大的突破性进步，发明了新的多聚螯合物酶法也称酶标多聚葡聚糖化合物法。随着技术的进步，ICC技术得到了更广泛的推广和应用，成为形态学领域中不可缺少的手段；同时也能为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测和治疗等提供重要依据，是临床实验室常规检查法之一。第一节酶的标记与染色方法一、酶标抗体法酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，在光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。（一）酶的种类及特点从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体进行ICC 染色，但实际上在 ICC 中所能用的酶并不多。用于标记的酶应具备以下六点：①酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察；②所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位；③获得的酶分子，最好有商品出售；④中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，活性不应改变，且酶的催化活性（turnover）越高越好；⑤酶标过程中，酶与抗体连结，不影响二者的活性；⑥被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶。（二）染色原理及显色剂的选择1．基本原理酶标抗体分为直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（多数抗血清系由家兔制得，单克隆抗体系由小鼠制得）；第二抗体则为第一抗体的抗体。所以，只要不同的第一抗体均来自同一种属，同标记的第二抗体结合就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。目前的 ICC 染色中，以间接法为常用。2. 酶标抗体显色原理及显色剂的选择（1）HRP：为 ICC 染色中最为常用的酶。其呈色原理如下：HRP+H2O2→HRP· H2O2+供氢体（电子供体）HRP+H2O+供氢体（氧化型）HRP 特异底物为 H2O2，在分解H2O2过程中，与H2O2形成复合物，无电子供体存在时，反应不再进行，当电子供体存在时，迅速生成水，酶被还原，电子供体被氧化、聚合，再经氧化环化后形成吲哚胺多聚体。在酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰。（2）AKP：是以AS-Mx为底物，FB／FR 为发色剂，生成蓝色／红色不溶性沉淀。AKP 标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的 ICC 染色。：染色结果可根据不同的显色底物而显示不同颜色，如用坚固红（FR／AS-MX）产生的底物为玫瑰红色，用坚固蓝（FB／AS-MX）则产物为紫绿色，而 BCIP／NBT 为紫蓝色。（3）GOD：是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、NBT 6.7mg、PMS（phenazinemethylsulfate）0.167mg，0.05mol/L PBS（pH 8.3），10.0ml，37℃孵育 1h。生成蓝色不溶性沉淀。该终产物不溶于有机溶剂，切片可脱水透明，长期保存。但GOD 的敏感度较HRP和AKP为低，电子供体少，应用较局限，主要用于两种酶的放大技术，能提高方法的敏感性和特异性。即用GOD和HRP 分别标记第二、第三抗体（例第一抗体为小鼠单克隆抗体，第二抗体为GOD 标记的兔抗鼠IgG，第三抗体则为GOD 标记的鼠抗IgG），ICC 染色，葡萄糖-DAB 作显色剂。二、非标记抗体酶法由于酶标抗体存在一些缺点，例如酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此 Stern-berger等在酶标法的发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（enzyme bridge method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidaseantiperoxidase method，PAP 法）（一）酶桥法基本原理：首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后利用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体上，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学