（新）荧光测定黄酮.docVIP

基于荧光光谱法对银杏黄酮糖苷的检测研究 温宗壮 中国矿业大学化工学院 摘要：银杏黄酮糖苷因具有多种生物活性而被制药、食品、日用品等诸多领域广泛应用。针对目前银杏黄酮糖苷检测操作繁琐、成本高、耗时长的不足，建立一种确性、低成本快速测定方法以芦丁为标样，在激发波长λex=400 nm，发射波长λem=520 nm，pH为3.6 的Al（NO3）3-（HAc-NaAc）1500 s，求得芦丁浓度与荧光值的线性回归方程为y=29.92x+36.49（R2=0.986），线性范围.8×10-6～3×10-5 mol/L。用这种方法检测了银杏细胞中黄酮糖苷的含量，并进行加标回收实验，平均回收率为101.3%。该方法 关键词：荧光光谱法 银杏 黄酮糖苷 引言 银杏黄酮具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤等诸多作用[1]。ultraviolet and visible spectrophotometry, UV）、 high performance liquid chromatography, HPLC）等方法是常用于检测植物中黄酮类化合物的手段。Zhu等利用紫外可见分光光度法对5种提取马齿苋黄酮方法的结果进行了检测[2]。Wang等也在刺五加上用同样的方法做过类似的研究[3]。法设备昂贵、仪器维护成本高、使用费时且测定各成分时需要标准品对照，使用成本也高，实力一般的科研机构难以接受通常为了得到更为精确的组分信息，经常与质谱（mass spectrum MS）、核磁共振（uclear magnetic resonance, NMR）等手段连用，进行定性定量检测。利用HPLC-MS13CNMR法从中鉴定了[4]。Anja[5] 、[6] 、[7]等都从不同的生物样本中分离鉴定了多种黄酮类化合物。在分析植物次生代谢物方面有许多报道。在检测银杏黄酮组分中也已经有了应用。Zhang等用毛细管电泳法检测了菊花黄酮，建立了浓度与电流响应的线性关系[8]。Chi等利用毛细管区带电泳分离检测了中国凉茶中几种黄酮物质，这种方法能高效分离、省时、所需样品少、重现性好[9]。 根据黄酮类化合物能与Al3+反应形成荧光螯合物的原理，本文建立了的荧光法Fluoro-spectrophotometry method，FSM）的检测手段Serbia等研究了荧光分光光度法对人血清桑色素的检测，以液相色谱法的检测结果为对照，表明两种方法的相对标准误差在可接受范围内，荧光分光光度法是可靠的[10]。本试验中以悬浮细胞为样品提取黄酮并测定其含量 1.1试验材料与试剂 银杏细胞为本实验室培养所得，烘干并碾成粉末，贮存于干燥器中暗处保存备用。氢氧化钠硝酸铝亚硝酸钠无水乙醇产自国药集团化学试剂有限公司。槲皮素98%）购于成都曼斯特生物科技有限公司，配制成0.05 mg/mL备用。去离子水。荧光分光光度计日本Hitachi公司FL-2700型号；高效液相色谱仪为戴安中国有限公司生产的Dionex P680型，反相C18柱250×4.6mm。 1.3 标样及样品的制备 精确称取芦丁标样0.01 g，色谱级甲醇溶解，定容至100 m，得到0.1 mg/m的标准溶液。取标准溶液1、2、3、4和5m，加入10%的Al(NO3)3及2.5 m的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用纯甲醇定容至25 m。精确称取烘干的银杏愈伤组织和样品1 g，按固液比1:加入甲醇，500 W超声波辅助萃取50 min后滤纸过滤，取试样加10%的Al(NO3)3溶液及2.5 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用甲醇定容。 荧光分光光度法测定中激发光谱通带和发射光谱通带均设定为5 nm，激发电压700 V，此条件下,扫描最佳激发波长和发射波长，考察铝离子添加量、缓冲液pH、甲醇浓度、反应时间对荧光强度的影响。并在的最佳色谱条件下测定各浓度标准溶液的荧光强度，建立回归方程。在相同条件下测定悬浮培养细胞黄酮提取液的荧光强度，根据回归方程计算含量。。 所有实验数据利用软件Origin pro 8.0处理。 2.1 最佳激发波长与发射波长的确定 对芦丁标准品进行激发波长和发射波长扫描，如图1所示当荧光强度最大时，激发波长λex=400 nm，发射波长λem=520 nm，所以选择激发波长λex=400nm，发射波长λem=520nm检测黄酮。 .2 Al(NO3)3的 考察了10% Al（NO3）3添加量分别为0、1、2、3、4、5和6 m与黄酮形成的螯合物荧光强度的影响。光谱图如下2所示： (a)1mLAl3 + (b)2mLAl3+ (c)3mLAl3+ (d)4mLAl3+