酶聯免疫吸附试验检测呕吐毒素测量不确定度评定.docVIP

酶联免疫吸附试验检测小麦中呕吐毒素测量不确定度评定的探讨 摘要 目的 探讨酶联免疫吸附试验( E L I S A) 检测呕吐毒素( DON ) 测量不确定度的评定。方法 按照《GB/T5009.1113-2003 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 第二法》， 分析测量过程的不确定度分量,合成各试剂盒检测系统的扩展不确定度。结果 总扩展不确定是 ( K= 2 ) 。结论 含有测量不确定度的结果基本能反映测量的 真实水平， 有助于了解 目前国产 E L I S A试剂手工法检测低水平 H B s A g的实际情况。 关键词 呕吐毒素； 酶联免疫吸附试验 ； 测量不确定度 酶联免疫吸附试验原理是将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加人一定量抗体与待检试样（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加人酶标记的抗免疫球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物结合，加人酶底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，根据标准曲线计算被测试样中的抗原量。酶联免疫吸附试验( E L I S A) 已广泛应用于食品、饲料、中药材中化学成分的测定，国标方法《GB/T5009.1113-2003 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》第二法规定了检测呕吐毒素的免疫测定（ELISA）方法。该方法具有简便 、 快速同时又不需要复杂的 实验设备的优势。但缺点是在样品处理、加样、孵育、洗板、比色等实验过程中存在诸多影响实验结果的不确定因素，对其测量不确定度的评定显得非常重要。本文以《 测量不确定度评定与表示》( JJ1059-1999 )为依据，测定粮食中呕吐毒素含量为例，应用酶标分析仪测定标液和样本的OD值，根据实验原理建立数学模型，分析使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中呕吐毒素，不确定度的计算方法和步骤，建立了酶联免疫吸附法测定呕吐毒素的评定方式。 1材料和方法 1.1材料 （1）呕吐毒素酶免检测试剂盒 批号江苏省苏微微生物研究有限公司； （2）小麦：送检样品。 1.2仪器 （1）万分之一电子天平( 岛津公 司)，型号AEL-200，量程0 g~200 g 最大允许误差±0.02（2）A级50 mL 单标线吸量管最大容量允差±0.050 mL。 （3）A级5 mL移液管最大容量允差±0.015 mL。 （4）200 uL 可调移液器，芬兰雷勃公司公司，经检定合格容量允许误差（%）±3.0重复性（%）≤ 1.5。 （5）酶标仪(奥地利SUNRISE公 司) 经计量部门检定合格，给出的重复性为0.0006； 1.3方法 按照《GB/T5009.1113-2003 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 第二法》进行测定。 2 建立数学模型 样品中呕吐毒素含量的定量数学模型为： DON 浓度（ng/g）= 式中：c —呕吐毒素含量，单位为纳克（ng），对应标准曲线按数值插入法求。 V1—试样提取液的体积，单位为毫升（mL）。 V2—滴加样液的体积，单位为毫升（mL）。 D—稀释倍数。 m—试样质量，单位为克（g） 3测量的不确定度分量的来源分析 按标准规定和试剂盒说明书， 测量 HB s A g基本流程为：称取5g粉碎样品于100ml带塞三角瓶中，加入50ml蒸馏水。充分振荡3分钟，然后用定性滤纸过滤，收集滤液。取滤5ml，加入5ml 超纯水或蒸馏水，混匀，定性滤纸过滤，此为样品待检液。分别加标准品或待测样品50μl，然后再加入DON 抗体50μl。酶标板反应30分钟。弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板4次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。每孔加酶标二抗 100μl，37℃，30分钟。温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板4次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干依序每孔加显色液100μl，反应0分钟依序每孔加终止溶液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 测量值(ug/kg） 970 976 1004 966 930 950 930 1002 966 980 残差(ug/kg） 2.6 8.6 36.6 -1.4 -37.4 -17.4 -37.4 34.6 -1.4 12.6 平均值（ug/kg） 964.7； 单次测量的标准偏差（ug/kg） 19 平均值的标准偏差（ug/kg） 6.0 相对标准偏差urel- 0= 0.12/3.47 ×100%=0.39% 3.2.2工作曲线拟合引入的标准不确定度u（c）， 由质量浓度分别为0,12.5,25,50,100,200ng/ml的DON标准溶液绘制标