酶聯荧光RFLP技术标准.docVIP

酶联荧光RFLP技术标准 1 全血或冻溶血抽提DNA 1.1 全血溶解 注：1）细胞溶解液（cell Lysis Buffer）pro-k）Protein Lysis Buffer）0.5ml血液样本而设定的，应精确保用各试剂用量。 ①移取0.5ml全血，加入标记5ml管。 ②加1.8ml细胞溶解液到各试验管，加盖，倒转数次使其混匀，置于冰盆内待到全部试验样本操作完备后，准备离心。 ③在水平台式离心机上离心，1250rpm，离心时间5min，注意在离心前一定要配平。 ④从离心机取出样本，仔细地倒去上清液，用新华滤纸吸取残剩上清液。注意，不要将离心沉淀物（pellet）2ml细胞溶解液，加盖，在旋涡混合器上，混匀沉淀团，重复第3-4步骤。 ⑦再在旋涡混合器上，混匀样本。 ⑧在第6步骤离心时，按下列配方准备蛋白酶混合液。 每个样本 ×10 ×20 ×30 ×40 ×50 ×60 Protein lysis Buffer 233.8μl 2.338ml 4.676ml 7.014ml 9.352ml 11.69ml 14.028ml Pro-k 3.7μl 37μl 74μl 11μl 140μl 185μl 222μl SDS 12.5μl 125μl 250μl 375μl 500μl 625μl 750μl Total 250μl 2500ml 5ml 7.5ml 10ml 12.5ml 15ml ⑨每样本管加蛋白酶混合液250μl，加盖，轻轻地倒转数次，禁止剧烈振荡。⑩将全部样本管放入恒温水浴摇床内，37±1℃培养2hrs，中速摇动。 ⑾每管加50μl高氯酸钠（Sodium Porchlorate）1.2 DNA抽取 注：1）抽提溶液I，II，III都是剧毒试验，应带乳胶手套、口罩，在通风处操作。 2）用前，全部抽提溶液复温。 3）对于上述全部样本管按下列步骤进行操作。 ①每样本管加等体积抽提溶液（约0.5ml），加盖扣紧，在室温倒转使之混合。 ②将全部样本管配平后，放置在水平离心机内2000rpm，离心7min。 ③Phenol相（淡黄色的有色相）在样本管液体的上层，吸弃Phenol相，继续进入第5步骤，假若Phenol相在样本管底部，液相（无色相）在上层，吸移上层液相和带有白色的界面层到新的管内，丢去Phenol相。 ④每样本加等体积抽提溶液II（约65ml）加盖扣紧，在室温倒转使之混匀。 ⑤离心2000rpm，离心时间7min，吸移上层相和界面到新管内。 ⑥每管加等体积抽提溶液Ⅲ，加盖扣紧，倒转混合。 ⑦离心2000rpm，时间7min，离心后小心从离心机内取出样本管，吸取上清部分，准备透析。 2 透析DNA 2.1 准备透析用具，试验器械、透析管、透析夹、透析液、容器、磁力搅拌机。 2.2 配制透析液1：100透析贮存液，配制2000ml。 2.3 准备透析管：将透析管剪成5cm长，一端用已标记透析夹封住，浸泡在透析液过夜备用。 2.4 将透析管从透析液中取出，用滤纸吸去残留透析液，吸移样本管上层相，放入透析管内，避免吸取界面，用透析夹封住另一端，放回透析液中，注意，认真验对透析夹与样本编号相对应，并记录。 2.5 样本透析在4℃冰箱中进行，磁力搅拌机搅动透析样本，每4h换一次透析液，共3次。 2.6 已经透析的大分子DNA在室温是稳定的，在4℃可以短期保存抽提DNA，若需要长期保存，应贮存在乙醇中，若者是在0.3M Ammonium Acetate。禁止冷冻大分子DNA。 3 DNA定量 3.1 制备0.8% Agarose凝胶 Agrose 1.2g 1×TAE Buffer 150ml 加到300ml三角烧瓶摇匀，放置微波炉中 2min，移出，用力水平摇匀，再放置微波炉 20秒，待冷至 65℃后，加 10μlEB·(mg/ml)，将150μl溶解胶，倾入水平的制胶板框内，在一端插入17孔的梳子，在室温使凝胶固化45分钟备用，将已制好凝胶板浸入电泳槽缓冲液中，注入1×TAE缓冲液2000ml，缓冲液面有胶面上1cm为宜。 3.2 在65℃的干热器上，将DNA定量标准30NG、20ng、10ng、5ng、1ng和DNA可视性大小标准，放置在干热器上5min，离心。 3.3 吸取样管DNA 2μl（吸前注意将样本混匀）与8μl×loading Buffer在微量反应板上混匀，备用。 3.4 加样，依次从右向左加DNA定量标准和样本： 3.5 电泳条件：输出端电压90V（或经过混胶两端电压调至50V），万用表检测其直流电压，电泳时间1hr，关闭电源。在电泳时，需要观察电压，电流，以确保电泳在进行，简便的方法是观察两侧电极是否有电解气泡连续上