DNS法测定α-淀粉酶活力的方法[精].pptVIP

比酶活力计算 定义：1mg蛋白质的酶活力单位。 计算公式： 利用DNS法测定α-淀粉酶活力的方法 目的要求 了解生物学研究中针对糖含量测定的常用方法及相关原理。 掌握一般标准曲线制作的意义及要求。 掌握DNS比色法测定α-淀粉酶活力的原理、方法及操作步骤。 掌握利用EXCEL分析工具库数据分析——回归分析，得到回归方程及相关分析结果。 糖的测定方法 大致可分为三类： 1.物理法——旋光法、折光法、比重法； 2.物理化学法——点位法、极普法、光度法、色谱法； 3.化学方法——斐林氏法、高锰酸钾法、碘量法、铁氰化钾法、DNS比色法、蒽酮比色法、咔唑比色法 生物学研究中关于糖测定中常用的方法 菲林试剂滴定——还原糖，常量分析 DNS比色法——还原糖，微量分析 蒽酮比色法——总糖，微量分析 配制系列浓度稀释液的方法 线性稀释——稀释液的浓度梯度是相同的（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0……）； 对数稀释（倍数稀释）——系列溶液的浓度比是一常数，取决于稀释梯度——2倍稀释（1、1/2、1/4、1/8……）；10倍稀释（1、1/10、1/100、1/1000……）； 调和浓度稀释——系列溶液的浓度为连续排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4，1/5……）。 α-淀粉酶酶活力测定的原理 底物（反应物）为淀粉——碘比色法（反应一定量淀粉为糊精的时间） 产物为麦芽糖、糊精等——麦芽糖为还原糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生成量（如DNS法），从而计算出酶活力单位。 DNS试剂测定还原糖的原理 淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下： 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 酶活力测定（DNS比色法） 酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ℃ ，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。 注意：去除β-淀粉酶的干扰（ β-淀粉酶不热耐，在70℃15min钝化 ）——植物材料来源需要注意。本此实验中忽略不计。 检测的原理： 酶解的产物之一——麦芽糖具有还原性，可以使试剂中的3，5-二硝基水杨酸还原，形成红色的物质，在540nm下有吸收峰，并和浓度呈一定线性关系。 计算公式：根据标准曲线计算。 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂配制说明 21g 氢氧化钠（先加入溶解）； 182g 酒石酸钾钠（同上）； 6.3g DNS（3，5-二硝基水杨酸），加热完全溶于上述溶液中； 5g 重蒸苯酚（冷却后加入）； 5g 无水亚硫酸钠（冷却后加入）； 完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越长越稳定。 引自： 朱俭，曹凯鸣，周润琦，蔡武城，袁厚积编著．生物化学实验．上海：上海科学技术出版社，1981． 标准曲线法 取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处（通常为λmax），用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度（OD）为纵坐标，系列标准溶液浓度为横坐标作图，得到一通过坐标原点的直线－标准曲线（工作曲线）。 理想的标准曲线满足以下条件： 1、至少5个点，一般不超过7个点； 2、2个以上重复值； 3、重复值误差小于5%； 4、点与线的垂直距总和最小； 注意：标准曲线不能任意延长！（有一定测定范围） 理想标准曲线的特点 过原点的直线； 斜率为1（45°）； 浓度为待测物质浓度的一半～二倍； OD值在0.05～0.8之间（最好控制在0.2 ～0.6）。 mg/ml 麦芽糖标准曲线的制作 取6支干净的具塞刻度25mL比色管，编号，按下表中加入相关试剂； 混匀后，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至25mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量（mg）为横坐标，吸光度（OD）为纵坐标，绘制标准曲线。——沸水浴时不要加塞！ 利用Excel中相关统计分析工具，完成回归方程的计算及分析，并绘制标准曲线图。 相关试剂（第一种） 标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸（C6H8O7·H2O ）5.78g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）21.32g ，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。 1%马铃薯淀粉溶液：称取1g马铃薯淀粉（105℃烘干2hr）溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中（一般需要密封121.3 ℃ 灭菌处理20min）。 相关试剂（第二种） 标准麦芽糖溶液（1mg