激光共聚焦显微镜原理和操作详解.ppt

激光扫描共焦显微镜技术 样品要求 原理 功能 在生物医学中的应用 激光扫描共焦显微镜技术及应用 The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光扫描共焦显微镜技术 人眼分辨率： 0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25mm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：0.18mm 激光扫描共焦显微镜技术 激光扫描共焦显微镜技术 激光扫描共焦显微镜技术 共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 激光扫描共焦显微镜技术 共焦显微镜与传统显微镜的区别 2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片 激光扫描共焦显微镜技术 共焦显微镜与传统显微镜的区别 3. 增加侧向分辨率  激光扫描共焦显微镜技术 共焦显微镜与传统显微镜的区别 4. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响  激光扫描共焦显微镜技术 三. 激光扫描共焦显微镜的设计特点: 1.点照明 2.具有照明pinhole和探测pinhole 3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面 4.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物 激光扫描共焦显微镜技术 技术指标（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比传统显微镜小1.4x 传统显微镜: Rxy=0.61?/NA （0.25 ?m ) Confocal: Rxy=0.4?/NA（0.18 ?m ) 2. 样品的最大厚度: 取决于: 物镜的NA、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围(166?m、Z-wide) 3. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm） 取决于: 物镜的NA、针孔大小 Z轴的最小移动步距: 40nm Z轴的分辨率: 0.35 ?m 激光扫描共焦显微镜技术 4. 激光器 Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm 激光器的特点: 1) 方向性好: 激光基本延直线传播 2) 单色性好 :??=10-8nm 3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度 集中的。 4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合 激光扫描共焦显微镜技术 5. 四个荧光通道, 一个透射光通道 即除了可同时采集多标记荧光图像外 还可以同时采集透射光图像,但透射光 图像为非共焦图像。 激光扫描共焦显微镜技术 6.扫描速度: slow 220lines/s 512?512 2-3秒 slow2 440lines/s（2：双向扫描） medium 450lines/s 512?512 1.7秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512?512 0.7秒 128?128 0.2秒 fast2 2000lines/s 7. 扫描密度: 64?64 128?128 512?512 1024?1024 2048?2048 激光扫描共焦显微镜技术的应用 The application of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光扫描共焦显微镜应用 功能. 1.多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集 2.无损伤、连续光学切片，显微“CT” 3.真正的三维重组 4.假三维图的显示 5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切 6.定量分析 7.时间序列扫描: xyt 、xyzt 和 xt 扫描 8.图像处理 9. 旋转扫描