16种天然植物化妆品中致病菌的分离及研究.docVIP

16种天然植物化妆品中致病菌的分离及研究 摘 要 随着经济的快速发展和人们生活水平的不断提高，化妆品安全问题受到越来越多人们的重视，微生物检验是化妆品质量控制的重要项目之一。海纳粉、薰衣草、奥斯曼均为新疆生产的天然植物性化妆品，近几年市场销售量很大，但我国对此类天然化妆品中微生物的研究甚少。因此，对新疆天然植物化妆品中致病菌的研究以及微生物快速检测方法的建立，是控制和提高天然植物性化妆品中微生物安全性能的重要手段，具有现实意义。本研究以16种天然植物化妆品为样品标本，采用薄膜过滤法中和抑制剂，对样品中致病微生物进行分离检验，通过VITEK 2生化鉴定系统对分离出的全部菌株进行鉴定，并应用美国Nccls 颁布的标准方法对已鉴定致病菌做药物敏感试验。最后以分离出的地衣芽孢杆菌 RpoB 基因、肺炎克雷伯氏菌phoE基因、铜绿假单胞杆菌gyrA 基因作为靶基因，设计3对特异性引物，建立三重PCR反应，实现快速检测这三种致病菌的分子生物学方法。 试验结果可知16种样品通过运用滤膜法，抑制防腐剂干扰试验，分离筛选出典型菌，结果较满意。采用薄膜过滤法，冲洗量为300 mL，接种7株代表菌的染菌回收率均高于90％，可见薄膜过滤法能有效去除防腐剂对含菌检出率的干扰。 对检出微生物进行分离筛选，革兰氏染色镜检，经过VITEK 2生化鉴定系统鉴定得到单一纯化菌株：粪大肠杆菌5株，金黄色葡萄球菌1株，铜绿假单胞杆菌3株，肺炎克雷伯氏菌6株，地衣芽孢杆菌10株，阴沟肠杆菌10株，链球菌1株，肠球菌1株。6类抗生素药物与试剂药敏试验结果均得到显著抑菌直径环，且各菌株呈现不同程度的耐药性，无出现重大错误判定结果。 利用oligo 7.0 软件进行序列比对设计的三种菌特异性引物，扩增出的产物测序序列在GeneBank上进行BLAST比对，同源性均达到99%以上。试验过程中所建立的三重PCR具有很高的敏感性和特异性，人工污染染发剂试验灵敏度检测下限分别为肺炎克雷伯氏菌4.5×10 CFU/mL；铜绿假单胞杆菌6×102 CFU/mL；地衣芽孢杆菌1×10 CFU/mL。试验通过对退火温度、3对引物、Mg2+、EasyTaq DNA Polymerase等参数的优化，确定三重PCR的反应体系和反应程序。结果如下： 10×Easy Taq Buffer（Mg2+）1.5μL，2.5 mM dNTPs 2.5μL，10μM gyrA 上下游引物各1.0μL、10μMphoE上下游引物各1.0μL、10μM RpoB上下游引物各0.5μL，模板DNA各2μL，5 U/μL EasyTaq DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O补足25μL；反应程序为：94℃预变性3 min；按照94℃45 s，58℃45 s，72℃ 60 s进行30个循环；最后72℃延伸7 min。 关键词：天然植物化妆品致病菌；膜分离；微生物生理生化；多重PCR； 中国化妆品的定义一般沿用欧盟化妆品指导性文件的定义，国家质检总局公布现行的《化妆品标识管理规定》，化妆品是指以涂抹、喷洒或者其他类似方法，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品。《化妆品标识管理规定》重点对对化妆品微生物检验、卫生化学检验、禁限用物质、化妆品的毒理学试验以及人体安全性等方面进行了规范[1]。在原料方面，我国化妆品新原料的定义为在我国化妆品中首次使用的原料。判断是否是新原料的标准要看其是否列于我国可使用的化妆品原料清单之外，我国对原料类天然化妆品重视度小，可能原料数据库更新不完整，但新疆出产薰衣草、奥斯曼及海娜粉类纯天然植物原料染发、精油、生眉化妆产品是在可使用的原料清单以内。 随着经济的快速发展和人们生活水平的不断提高，化妆品安全问题受到越来越多人们的重视，而微生物检验是化妆品质量控制的重要项目之一。化妆品生产过程中使用的原料、容器和制作过程中均可受微生物污染，尤其在冷却灌装过程更易受污染。化妆品各种原料都有被微生物污染的可能，其中尤以天然动植物成分、矿产粉剂、色素、离子交换水等原料易受微生物污染。2013年就有报道，澳大利亚竞争与消费者委员会（Australian Competition Consumer CommissionACCC）对多种化妆品进行安全测试，发现有3种产品的微生物污染水平严重超标，ACCC将对微生物超标的问题产品进行回收。不同种类化妆品的染菌特点及其它们各自特的菌膏霜类（护肤类）这类化妆品微生物的污染率最高，受污染的微生物种类也最多；有粪大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等。发用类化妆品富含水分及微生物生长所需的营养较易繁殖绿脓杆菌等细菌与霉菌。粉类化妆品主