{新}大肠杆菌与合成生.ppt

在大肠杆菌内引入甲羟戊酸途径高效合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11- 二烯 汇报人：马纳纳 2012年11月2日 合成生物学： 一门生物学与工程学交叉的前沿学科, 以生命科学理论为指导, 以工程学原理进行遗传设计、基因组改造( 重组染色体) 和（或）合成以及人造细胞合成。其中, 基因组改造( 重组染色体) 和（或）合成是关键。 2010年5 月20日, 以克雷格·文特尔为首的美国科学家, 在Science上公布了人类历史上创造出首个“人造单细胞生物”的消息，以这项成果为代表的合成生物学(synthetic biology, Synbio)也就受到了前所未有的关注。 合成生物学如何创造生命 用A 、G 、C 、T 为代表的化学物质人工合成DNA(脱氧核糖核酸) 片段, 由DNA片段合成基因,再由基因组合成生物模块, 然后装配成“人造基因组”, 最终在实验室里创造出全新生物体。 合成生物学与大肠杆菌 合成生物学中的底盘生物是合成生物学的“硬件”基础。大肠杆菌(Escherichia coli) 作为最简单的模式生物，由于其背景清晰、生长快速、易于操作，在基础生物研究以及生物技术应用方面有着其他模式生物无可比拟的优越性。 大肠杆菌已经成为能源、化合物、材料及药物 生产的重要平台，合成生物学的发展促进了大肠杆菌代谢途径的重建，通过精确设计基因环路、重构代谢途径为大肠杆菌提供了新的代谢和生理功能，使其能够高产天然甚至非天然产物。 在过去的十年里，基于大肠杆菌的系统生物学得到了迅猛发展。 大肠杆菌与青蒿素的合成 青蒿素(artemisinin) 是中国科学家于20世纪70年代从传统中草药青蒿或称黄花蒿( Artemisia annua L.)中分离提纯的抗疟有效单体, 其化学本质是含有“ 过氧桥” 结构(1,2,4- 三噁烷环) 的倍半萜内酯。 以青蒿素为母核经人工半合成获得的青蒿素琥珀酸酯( 青蒿琥酯) 、青蒿素甲醚( 蒿甲醚) 、青蒿素乙醚( 蒿乙醚)和双氢青蒿素等青蒿素类药物, 血中溶解性好, 生物利用度高, 对氯喹抗性疟疾及致命性脑型疟有特效, 已成为世界卫生组织(WHO)倡导的“ 基于青蒿素的联合疗法”(artemisinin-based combination therapies, ACTs)首选的抗疟新药。 青蒿分布地域狭窄, 青蒿素含量低(0.01%~ 0.5%). 化学合成青蒿素产率不理想, 成本高. 随着全球疟疾发病率(3.8 亿人/ 年) 和死亡率(4600 万人/ 年)逐年升高, 青蒿素类抗疟药需求量迅猛增长, 导致青蒿素原料药供不应求, 市场价格飙升. 近10年来, 为了从根本上解决青蒿素的供需矛盾, 国内外争相开展了青蒿素合成生物学及代谢工程研究, 一方面尝试在微生物体内重建青蒿素生物合成途径, 另一方面对青蒿中原有的青蒿素生物合成途径进行遗传改良 大肠杆菌与青蒿素前体 大肠杆菌内存在以脱氧木酮糖磷酸 (Deoxyxylulose-5-phosphate ，DXP) 途径为基础的类异戊二烯代谢途径，能合成少量的辅酶Q 等。故大肠杆菌非常适合作为生物合成类异戊二烯化合物的宿主菌。 本研究在大肠杆菌中引入人工合成的紫穗槐- 4,11- 合酶基因并构建原核的粪肠球菌 Enterococcus faecalis 来源的MVA途径，获得了抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11- 二烯的高表达。 这种微生物半合成青蒿素的方法——先通过改造微生物合成途径获得青蒿素的前体紫穗槐- 4,11-二烯或青蒿酸等，再采用相对简单的化学催化步骤可将这些前体转化成青蒿素，可以大规模制备青蒿素，解决资源短缺问题。 基本思路： 首先在大肠杆菌Escherichia coli DHGT7 中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因，利用大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸，成功获得了紫穗槐-4,11- 二烯。 为提高前体供给，引入粪肠球菌的甲羟戊酸途径，紫穗槐-4,11- 二烯的产量提高了13.3 倍，达到151 mg/L。 进一步研究发现了3 个限制酶，分别是紫穗槐-4,11- 二烯合酶、HMG-COA 还原酶和甲羟戊酸激酶；通过调节这些酶的水平，紫穗槐-4,11- 二烯产量提高了7.2 倍，在摇瓶中达到235 mg/L。 1. 载体构建、目的基因表达 采用常用分子克隆技术，如PCR