实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定免疫球蛋白总结.ppt

（4）“纹理”现象由于样品中的不溶颗粒引起的。 （5）偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起 （6）带太宽 加样量太多或加样孔泄漏引起 实验三 目的蛋白Western Blotting检测 一、目的 1、了解Western Blotting的原理及其意义，掌握Western Blotting的操作方法； 2、应用Western Blotting技术鉴定经SDS分离后的目标蛋白。 二、原理 Western Blotting简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经SDS电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，即可检测出样品中的特异蛋白质组分。 三、试剂与器材 1、膜转移缓冲液 2、TBST缓冲液 3、封闭液 含有5%脱脂奶粉的TBST液。 4、DAB显色 实验器材 半干转移槽 PVDF (聚偏氟乙烯)膜 两张厚的滤纸 刀片 塑料盒 四、操作步骤 1、当表达产物的SDS电泳结束时，带上手套，剥胶，切6-8张滤纸和一张PVDF膜，它们的大小与凝胶完全吻合。 2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min 3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路）提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上，再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺上滤纸并压走多余液体。 4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM） 半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。 6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min 7、加入一抗，室温平缓摇动2h； 8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 9、加入二抗，室温下孵育1h； 10、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 11、显色 在DAB中显色约10-30min，待蛋白质带的颜色深度达到要求后，用水漂洗，拍照或扫描。 实验报告要求与思考题 1、就实验中出现的各种问题进行分析讨论。 2、在不连续体系SDS中，当分离胶加完后，需在其上加一层水，为什么？ 3、为什么样品电泳前要高温加热？ * 实验二 SDS分离鉴定免疫球蛋白 一、目的 1、了解和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理； 2、掌握用此法分离鉴定纯化蛋白质的操作方法。 二、原理 1 电泳技术基本原理 电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 聚丙烯酰胺凝胶 SDS 是一种阴离子表面活性剂.它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低甚到消除。与些同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅仅取决于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。 SDS四肽链结构 所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重链（H）和两条轻链（L）。 三、试剂与器材 1、30%的丙烯酰胺 2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵 5、5xSDS电泳缓冲液 6、浓缩胶缓冲液（PH6.8） 6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml. 7、分离胶缓冲液（PH8.8） 36.3g Tris,48ml 1mol/L HCl, 加水至100ml. 8、5xSDS凝胶上样缓冲液 四、实验步骤： 1、聚丙烯酰胺凝胶的制备 根据目的蛋白质的相对分子质量大小确定凝胶使用浓度，浓缩胶一般为3%~5% 蛋白质相对分子质量/×103 凝胶浓度/% 500 2~5 100~500 5~10 40~100 10~15 10~40 15~20 10 20~30 分离胶浓度与蛋白质分子质量的关系 1、配制10ML12%分离胶 2、装配好电泳用双层垂直玻璃板，保证底部不漏水。将混合均匀的 分离胶