DNA分子標记技术原理及操作流程.docVIP

RAPD分子标记的实验原理及操作流程 RAPD标记 RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR，单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点 DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。 一、实验材料 　　不同来源的DNA(30-50ng/ul)。? 二、实验设备? 　　PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。? 三、试剂? 　　1、RAPD引物：购买成品或根据赛百盛（SBS）公司设计的RAPD引物序列（/pro11_1.asp）合成。 　　2、Taq酶 　　3、10xPCR 缓冲液 ??????? 4、MgCl2：25mmol/L。? 　　5、dNTP：2.5mmol/L。? 四、操作步骤：? 　　1. 在15ul反应体系中，加入? 　　模板DNA 1ul (30-50ng)? 　　RAPD引物 1ul (约5pmol)? 　　10xPCR Buffer 1.5ul? 　　MgCl2? 1ul? 　　dNTP? 1ul? 　　Taq酶 0.5单位（U）? 　　加ddH2O 至 15ul? 　　混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。? 　　2. 在PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共40轮循环。? 　　3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。??????? 4. 在15ul PCR产物中加2ul上样缓冲液(6x)于1.6% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ。 ??????? 5. 电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。??????? 6. 用凝胶成像仪观察、拍照。 操作流程简图： 注：样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品，标本等???? DNA提取可采用CTAB或SDS法???? DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法 AFLP原理和操作步骤 一、原理 AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增,然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳,多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接,连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。实验中,根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物,可以达到选择性扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段,进行结合,导致特异性扩增。 二、实验试剂 Taq酶 EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接头 E+A引物M+C引物T4DNALigaseE和M引物琼脂 过硫酸胺丙烯酰胺尿素硝酸银甲酰胺 dNTPs 二甲苯青 冰醋酸玻璃硅烷50bpMark 三、操作步骤 （一） 基因组DNA提取和纯化A 、参考实验一的大量提取DNA实验方法， B、DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化,首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次, 离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇,－20℃放置2h以上，10000g离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ,风干后溶于30μlTE缓冲液中，UV-2401PC(岛津)紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。 注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300ul，此时DNA浓度大约为100ng/ul。（二）限制性酶切及连接在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng,2.5μl 10×酶切缓冲液, 2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ, 5U MseⅠ,2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头（序列见表2），双蒸水补至25μl。用PE公司PCR扩增仪设定37℃过夜反应后，于65℃20min灭酶活，－20℃保存，作为预扩增