基因组序列注释--功能基因组学8总结.ppt

Xiaofang Xie College of Life Science Fujian Agriculture and Forestry University E-mail:xxf317@ 为什么需要功能基因组学？ 虽然从结构基因组学可以揭示基因组中基因的数量和分布，并预测基因的种类和功能，但这仅仅是预测而已，并不能肯定其确切功能，而且有许多基因的功能还无法预测。 从结构基因组学也无法知道各个基因参与了哪些生命过程，其表达是如何调控的，不同基因之间是如何互作的。 总之，从结构基因组学无法了解基因的确切功能、表达调控以及相互作用。功能基因组学的产生正是为了研究这些内容。 功能基因组学是反向遗传学 传统的遗传学也称为正向遗传学，它是在已知基因功能的前提下，去寻找基因（序列）的，亦即“从功能到基因”。 功能基因组学正好相反，它是在已知基因（序列）的前提下，去寻找基因功能的，亦即“从基因到功能”，所以也称为反向遗传学。 正向遗传学的研究方法 图位克隆法：根据目标基因在染色体上定位的结果，对目标基因进行克隆，最后了解其核苷酸序列。 转座子（或T-DNA）标签法：利用转座子（或T-DNA）插入引起的突变，克隆控制突变性状的基因。 图位克隆（Positional Cloning） 图位克隆又称基于图谱的克隆（map-based cloning）。首先是寻找与目标基因紧密连锁的标记，然后通过染色体步行方法（chromosome walking）建立局域物理图，找到与目标基因共分离的BAC克隆。进一步通过亚克隆和遗传互补试验（将野生型基因转入突变体中），找到目标基因。 转座子标签 / T-DNA标签（Transposon Tagging / T-DNA Tagging） 转座子转座插入是一个自发的过程，而T-DNA插入则是通过转基因产生的。转座子插入和T-DNA插入引起突变的频率要比自然突变的频率高。因此，在已知存在转座子的群体或转基因后代群体中发现的突变体，很可能是转座子或T-DNA插入引起的。通过转座子或T-DNA标签克隆基因的方法主要有以下三种： 菌落原位杂交法（in situ hybridization） 反向PCR法（inverse PCR, IPCR） 质粒拯救法（plasmid rescue） 菌落原位杂交法 建立突变体基因组DNA克隆文库，以转座子序列为探针与菌落克隆杂交，阳性克隆即包含被转座子插入的目标基因。 反向PCR法 将突变体基因组DNA进行限制酶切，然后用连接酶使之连成环状。依据转座子序列设计反向引物，进行PCR，即可扩增出目标基因片段。为了提高特异性，可以采用巢式（nested）PCR方法。 质粒拯救法 经过改造的转座子带有质粒的复制原点和选择标记基因，从而犹如一个载体。将突变体基因组DNA酶切并连接后，可以得到转座子和目标基因片段组成的环状DNA。用它转化大肠杆菌，目标基因片段即被克隆出来。 反向遗传学的研究方法：针对特定基因 消除或抑制基因的表达 基因敲除（gene knockout） 反义RNA（antisense RNA） RNA干扰（RNA interference） 提高或改变基因的表达 使目标基因过量表达（overexpression） 使目标基因异位表达（ectopic expression） 基因敲除 在体外先将某个基因的内部插入一个选择标记基因，使该基因失活。并将包含该失活基因的染色体片段组装到载体上。导入细胞后，通过同源重组，失活基因会取代细胞中原来正常的基因，从而产生基因失活突变体。 反义RNA 将目标基因颠倒过来，使其编码链变成模板链，而模板链变成编码链，即成为该目标基因的反义RNA基因。将反义基因转入到植物细胞中，反义基因将转录出反义RNA，而反义RNA会与目标基因的mRNA结合，使之无法翻译，从而达到抑制目标基因表达的目的。 RNA干扰（RNAi） RNA干扰是指dsRNA（双链RNA）在细胞中可以诱发与之同源的mRNA降解，从而导致编码该mRNA的基因沉默的现象。 RNA干扰的最初证据来自1995年Guo和Kemphues对线虫的研究。他们发现，将par-1基因的反义RNA和正义RNA注射进线虫体内，都能引起该基因的沉默。 基于该研究结果，1998年Andy Fire首次在线虫中证明，dsRNA可以有效地、特异地抑制基因的表达。 RNA干扰所需的酶 Dicer：为RNase III家族的一个成员，可以产生双链小型干扰RNA（siRNA，长度21 ~ 23bp）。该酶含有多个结构域，包括一个解旋酶结构域，两个相邻的RNase III结构域，以及一个dsRNA结合基元