第二章生物分离和提取技术报告.ppt

2.7 沉淀分离技术 有机溶剂沉淀 高聚物沉淀 盐析 聚电解质沉淀 谢谢！ * 絮凝的作用 1、滤速加快、滤液更清，改善滤液质量，去除杂蛋白与固体杂质 2、可在胞外循环 利用基因工程手段，可以得到自身絮凝和沉降性能很好的酵母。 絮凝酵母与传统的固定化细胞相比，具有以下优点：不需要固定化细胞载体、成本低、节省空间、可以获得高菌体浓度，实现连续发酵。 * 3、酶分离纯化 细胞破碎——絮凝——酶 例： ?-半乳糖甘酶（胞内酶）的分离纯化 ——细胞破碎——离心分离——澄清液 ?-半乳糖甘酶发酵液 壳聚糖+聚乙酰亚胺 CaCl2 调节pH 细胞碎片+部分可溶性杂蛋白 ?-半乳糖甘酶的活性没有影响 * 影响因素 1、絮凝剂浓度：浓度上升，有利于架桥；浓度过多，引起吸附饱和，形成胶粒，产生二次稳定。 2、分子量：分子量上升，有利于架桥，但水溶性降低。 3、pH值：影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响分子链的伸展，电离度上升，伸展状态上升。 助滤剂的加入方法 （1）预涂层：一种是在过滤介质表面预先涂一层助滤剂（涂层厚约1～2mm） （2）直接加入：另一种是将助滤剂直接加入发酵液中，两种方法也可同时使用 细胞收集技术（固液分离技术） 1、过滤 2、离心 3、膜分离 * 则离心沉降速度为： * 3.2离心方法 3.2.1差速离心 目的：以菌体细胞的收集或除去为目的，是分级离心操作的一种特殊情况，称为一级分级分离。 在差速离心操作中，离心转速和时间等操作条件要根据实际物系的特点（目标产物和其他组分的性质和相互作用）、分离的目的和所需的分离程度来选择，从而使料液中的不同组分得到分级分离。 根据离心方式的不同，分为差速离心和区带离心 * 主要菌体和细胞的离心分离 菌体、 细胞 大小/μm 离心力/g 菌体、 细胞 大小/μm 离心力/g 实验室 工业规模 实验室 工业规模 大肠杆菌 2-4 1500 13000 红血球 6-9 1200 ------- 酵母 2-7 1500 8000 淋巴球 7-12 500 ------- 血小板 2-4 5000 ------ 肝细胞 20-30 800 ------- * 细胞破碎液的差速离心分级 细胞破碎液 离心600g，10min [沉降层] 细胞核(4-6μm) [上清液] 细胞膜碎片 线粒体(1μm) 溶酶体(0.25-0.5μm) 核糖体(18nm) 水溶性物质 离心10000g，10min [沉降层] 细胞碎片 线粒体 溶酶体 [上清液] 核糖体 水溶性物质 离心100000g，3h [沉降层] 核糖体 [上清液] 水溶性物质 * 根据离心操作条件 差速区带离心 平衡区带离心 沉降系数不同的组分在密度梯度中会形成各自不同的区带。差速区带离心的密度梯度中最大密度小于待分离的目标产物的密度。在密度梯度中，料液中的各个组分就会由于沉降系数的差异而以不同的速度沉降，产生与组分对应的区带。 差速区带离心的原理 3.2.2 区带离心 * 离心之前要先用某种低分子量溶液（如蔗糖溶液）调配好密度梯度，操作可在离心管中完成。其次，将待处理的料液加在密度梯度之上，就可以进行离心操作了。 两种区带离心法的共同之处 1、平衡区带离心密度梯度比差速离心的密度梯度大 2、料液中的高分子溶质在与其自身密度相等的溶剂密度处形成稳定的区带，区带中的溶质浓度以该密度为中心，呈高斯分布。 平衡区带离心 * 1、事先调配好的不同浓度的蔗糖溶液，依浓度由大到小逐层加入离心管中即可形成密度梯度。 2、如果要制成连续的蔗糖密度梯度，则将一定浓度的蔗糖溶液高速离心一段时间即可。 3、除蔗糖外，如CsCl（可用于核酸的分离）和NaBr（可用于脂蛋白的分离）等，在离心力的作用下可以自动形成密度梯度。 4、区带离心法一般适用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化。 5、缺点是处理量小，仅限于实验室规模。 方法： * 2.3 细胞破碎技术 1、机械法破碎 2、化学法 3、酶法 4、选择性释放 胞内蛋白质的提取方法 1.化学处理提取法 2.双水相提取法 3.溶菌酶提取法 4.渗压冲击提取法 5.电脉冲提取法 6.分步、分级提取法 1.化学处理提取法 通过使用较弱的化学试剂如螯合剂、有机溶剂、表面活性剂等作用于细胞，改变其表面特性，特别是细胞通透性，使目标产物得以有效提取 2. 双水相提取法 双水相体系被广泛用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离纯化 处理量大、速度快、容易放大且不易变性 3. 溶菌酶提取法 如用β-1,3-甘露糖苷酶可以提取出分布在细胞壁表面和内部的甘露糖蛋白，从而改变细胞的多孔性和渗透性，达