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报告正文 （一）立项依据与研究内容 1．项目的立项依据 肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic 1ateral sclerosis，ALS）是神经系统变性病中的代表性疾病之一，同时也是一种进行性致死性疾病，病变主要选择性地侵犯上下两级运动神经元。由Charcot于1869年首次报道，迄今在该疾患治疗上仍一筹莫展，归根到底对于其病因及发病机制在理论上认识十分有限。 ALS按发病形式分为散发性（SALS）和家族性（FALS）。两者有相似的临床和病理特征。强烈提示两者之间虽有病因方面的差异，但在部分信号传导通路环节上可能有着相似的发病机制。然而，患者出现临床症状时，就已经有大量运动神经元死亡，神经活检可见运动神经元线粒体肿胀，空泡变性、轴突肿胀、胞内包涵体。这些改变究竟是运动神经元变性的原因？或仅仅是神经元损伤的阶段性结果？不得而知。故寻找始发的病变有助于阐明发病机制。 大量实验证实亚临床期甚至胚胎发育期的运动神经元就出现了病理、电生理、生化方面的异常。研究者发现2周龄SODl突变小鼠脊髓组织中出现运动神经元线粒体肿胀、胞质空泡形成，其发生早于肌无力的出现[1]。而运动神经元电生理异常也分别在出生1周的SODl突变新生小鼠、胚胎发育期15天（E15）的胎鼠得到证实[2,3]。对胚胎发育更早期的运动神经元研究发现，E12.5天的SODl突变胎鼠运动神经元nNOS转录增高，并出现涉及多个分子：细胞色素C、caspase3生理性凋亡途径易感性增高，极易被邻近胶质细胞释放的细胞因子，如NO激活[4]。而SODl突变小鼠及ALS患者的星形胶质细胞NOS水平增高，分泌N0增多[5,6]。 SODl突变的运动神经元线粒体肿胀，苍白，呼吸链复合物活性低下[7]。有人推测线粒体功能障碍可能是导致神经元死亡的始因[1]，由此激发了一系列的神经元变性级联反应：细胞能量缺失→神经元膜电位异常→细胞凋亡[8]。而且线粒体DNA（mtDNA）的突变或缺失（遗传性或获得性）被认为是导致线粒体功能障碍的关键原因之一[9]。mtDNA缺失的细胞更易受到外界因素的刺激而诱发凋亡[10]。 那么以线粒体为中心的一系列重要的异常变化：mtDNA的突变或缺失、电生理异常及凋亡易感性增高发生在胚胎发育生物学的哪一个时间阶段？胚胎发育过程中细胞生存与死亡调控的建设性作用与所带来的病理生理性效应究竟情况如何？导致这些异常变化的始因是什么？哪些异常变化是导致运动神经元变性的直接原因？以上系列问题均是重点需要解决的问题。 尽管出生后运动神经元功能负荷较其他类型细胞重，但SODl突变基因必须同时累及运动神经元与相应的胶质细胞才会出现选择性的运动神经元变性凋亡[11-13]。 因此，我们推测可能有以下情况发生：FALS患者在胚胎发育的过程中，突变基因所致的毒性作用可能导致尚处于早期分化的神经干细胞mtDNA的突变或缺失、细胞线粒体功能异常、凋亡易感性增高。而神经元分化之前这一阶段是FALS病理损伤机制发生的重要时刻。活性异常的胶质细胞可能承担了启动病理机制的的伴侣细胞的角色。这一假说若能被证实，则可能一定程度证实FALS是缘于干细胞分化阶段异常的疾病。而SALS的mtDNA在外界因素及异常活性的胶质细胞的影响下产生突变或及缺失，最终的病理损伤信号传导通路与FALS相似。 转基因小鼠的胚胎体积小，取材困难，因此极大地限制了人们对于ALS疾病还处于胚胎发育“超早期”阶段病变的研究。目前人们获得的最早的病变证据局限于小鼠胚胎12.5天。显然，人类ALS发病时程与鼠ALS发病时程不同，人与鼠的种属差异使得对动物行之有效的治疗方案对人无效，这充分说明用动物所得到的数据没有完全真实的、适时地反映人类ALS发病机制的实际过程。总之，现有的研究ALS的动物模型不能完全真实、客观地反映人类ALS发病机制、限制了人们对ALS疾病处于胚胎发育超早期病变的研究，而刚好此阶段又是最关键的时刻，故寻找能够更客观、准确、全面再现ALS病理、生物化学的疾病模型是明晰ALS发病机制的关键任务。人胚胎干细胞（hESC）系的建立为解决这一问题提供了契机。它来源于种植前胚胎内细胞团的高度未分化细胞，具有发育的全能性，在一定条件下能分化出成体动物的所有组织和器官。故胚胎干细胞是研究多细胞谱系发育的独一无二的体外模型[14,15]。近期，人类胚胎干细胞能在体外成功的诱导分化为运动神经元[16]，为ALS发病机制及治疗的研究提供了全新的契机，带来了曙光。与转基因动物相比，用人类胚胎干细胞作为研究模型不仅可以进行疾病早期发病机制探讨，可控性的观察疾病发生发展的全过程，更能真实的反映人类ALS发病机制，而且体外细胞模型能很好地克服体内模型存在的内环境干扰，易于添加并观察干预因素对疾病发生发展过程的影