【2017年整理】《免疫学基础及实验技术》-修.docVIP

《免疫学基础及实验技术》 实验报告 姓名: 姚丽君 专业：针灸推拿学 年级：2002年研究生 实验室：免疫试验室 时间：2003年1月12日 教师：李永念老师 免疫学教研室 人血清I的提取及鉴定 主要原理： 离子交换层析提取人血清I gG：离子交换剂采用DEAE-纤维素，是表面交联有二乙基乙胺基团的纤维素，本身带有真电荷，能吸附阴离子。DEAE-纤维素悬浮在PH高于6.5，克分子浓度低的缓冲液内，置备成层析柱。人血清经过PH7.4磷酸缓冲液透析平衡后，其中的IgG不带电荷或仅带少量电荷，其他的蛋白质则主要带负电荷，这样的血清样品通过相同缓冲液平衡好的DEAE-纤维素柱，除IgG以外的血清蛋白都吸附在柱上，仅IgG最易形成吸附-解离-再吸附-再解离的状态，因此能随洗脱液一起最早从柱中流出，收集洗脱液获得IgG。 血清I鉴定：以收集的洗脱液为抗原，与兔抗人IgG做琼脂双扩散实验，可根据沉淀线的形成确定IgG抗原性。用免疫电泳法使血清中各种蛋白的分子大小以及电荷状态、电荷量均有差异，因而它们的泳动速率也不相同，根据在凹槽中加入免抗人血清，上下两孔加入用蔗糖包埋法进行浓缩后的浓缩液和正常人血清，经一段时间后出现沉淀弧，根据沉淀弧的情况来检测所获的IgG的纯度。用754型分光光度计于280nm紫外光源测定洗脱液光密度值，根据IgG的E1cm1%=14.3(OD)公式，可计算出收获的IgG含量，并推算出所获得IgG的百分率。 主要材料： 0.5N NaOH、0.5N HCL 、0.85%NaCL按常规配制 DEAE-纤维素 健康人全血 PH7.4 0.01M磷酸缓冲液 20%三氯醋酸水溶液按W/V比例配制 蔗糖（研成细粉状） PH8.6 0.025MBA巴比妥纳-巴比妥缓冲液，2M NaCL水溶液 1.5%琼脂凝胶 布氏漏斗、抽滤瓶、水泵、试管，烧杯，玻璃棒，滤纸试纸、蝴蝶铁架、透析袋、离心机，746-电泳仪、754型分光光度计 三、操作步骤： （一）DEAE-纤维素预处理： 称取DEAE-纤维素1２克，均匀撒在事先盛有150ml 0.5NNaOH的烧杯中，人其自由沉降，放置４０－５０分钟，不时地用玻璃棒轻轻搅动。 将湖状物移入垫有滤纸的布氏漏斗中，连接漏斗抽滤瓶，并用水泵抽干糊状物。立即将DEAE-纤维素移入烧杯中，加蒸馏水，浸泡20-30min并不时搅拌，再移入漏斗抽干，如此重复，至洗出的PH值等于8即可。 将交换剂移入150ml 0.5N HCL中放置40-50min，不时轻轻搅动，移入布氏漏斗抽滤，再依同法用0.5N NaOH处理一次，时间不超过50min。 重第2项操作，至抽滤液PH值等于8即可，最后PH7.4 0.01MPB液浸泡交换剂，抽干，再重复一次，然后将交换剂用相同PB调成糊状，保留至装柱。 装柱、平衡 固定层析柱在蝴蝶铁架上，垂直。柱上方放置PH7.4 0.01MPB液的洗脱瓶，以乳胶管相连，柱底部有细胶管，装止水夹，调节流速。 将上糊状物倾入柱中，打开柱底流出口，用烧杯接流出液，注意不能断层，纤维素中不允许进空气，柱上表面要平，上部要留有约3cm高空间。 上样和洗脱 将人血置离心机以2000rpm，10min离心，取出并用毛细吸管吸取10 ml人血清装入透析袋，于烧杯内浸入40倍于血清体积的起始缓冲液中，置4℃冰箱内透析过夜，中途更换两次缓冲液; 打开柱上端塞子，用带有橡皮乳头的毛细吸管吸出交换剂表面的缓冲液，至仍2mm厚的液面，以免空气进入; 用清洁细吸管将已平衡好的血清样本原柱管内壁缓缓加在纤维素柱表面，调节流速，使样品进入交换柱内，约3ml/10min; 待液面还约2mm厚的样品时，用少量起始PB冲洗柱内壁，到PB进入交换剂仍留有2mm后液面时，再冲洗二次，保持柱面平整; 最后加适量起始缓冲液，连接洗脱瓶，流速调至30-40ml/cm2/h ; 收集洗脱液与试管中，每管5ml，共收集12管。并从各管中取1-2滴，加20%三氯醋酸1-2滴检测。 洗脱液抗原性鉴定 用1.5%琼脂凝胶制版，根据下图用打孔器打孔： 加样：中心孔加入兔抗人IgG，从收集的12管洗脱液中用毛细吸管吸取洗脱液分别加入周围六孔，每孔所加样品的量以液面与孔测平齐为准； 将琼脂板置湿盒内37℃温箱孵育24小时，观察结果。 IgG纯度鉴定 琼脂板制作：用1. 5%琼脂凝胶加热融化后倾注在载玻片上，玻片上放一条细玻棒，等凝胶凝固后在玻棒上下两侧打孔，制成如图所示： 洗脱液的处理：将通过离子交换层析法收集的12管洗脱液，用754型分光光度计测各管洗脱液在波长280nm的光密度值，第一个蛋白峰为IgG，收集有IgG活性的三管洗脱液，混合后装于透析袋内，用蔗糖粉末将其包埋使其浓缩； 加样：如图示上孔加入浓缩的IgG提取液，下孔加入正常人血清，