【2017年整理】志贺氏菌,的监测方法,.docxVIP

志贺氏菌是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位。为了能够有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病，对水或食品中志贺氏菌的快速检测与鉴定显得十分重要。本文主要介绍了志贺氏菌的各项检测技术及其优缺点，并对志贺氏菌的检验技术进行了展望 ?志贺氏菌的检测方法? 随着生物实验技术的发展，志贺氏菌的检测和鉴定技术也在不断的完善，大致可分为三大类：常规生化鉴定方法、免疫学方法以及分子生物学方法。其中最为常用的是分子生物学上的常规PCR检测。? 2.1?常规生化鉴定方法? 常规生化检测须经过增殖培养、分离纯化、生化试验、血清学实验等，检验步骤繁琐、耗时长、准确性低，且一次检测完成样品项数较少[5]，不能应对市场需求的快速准确检验方法的要求。但这种方法具有直观、准确、稳定性好且假阳性率低等特点，因此一直被沿用至今。国家标准方法[6]中采用常规生化鉴定方法对志贺氏菌进行检测，整个过程需要4～5d。通过对SS?培养基、Mac?培养基、HE?培养基和MT?培养基进行比较，发现SS?培养基对志贺氏菌的检出率最高。为防止漏检其他菌型，可同时采用Mac?培养基来提高检出率。? 2.2?免疫学方法? 免疫学的发展为致病菌的快速检测提供了新方法，同时大大提高了致病菌检测的灵敏性和特异性。除了凝集实验、沉淀实验和补体实验等经典的免疫学检测方法，以免疫学方法为基础建立起来的检测技术也已被应用于志贺氏菌的检测。? 2.2.1?酶联免疫技术? 酶联免疫技术?(enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA)?是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。建立间接?ELISA?方法以检测检测志贺菌纯培养液，其检出限为105～106CFU/ml；建立双抗夹心?ELISA?方法检测含0.1～1CFU/ml?志贺氏菌的样品在增菌13h?后可检出阳性反应，含1～10CFU/ml志贺氏菌的样品在增菌11h?后可检出阳性；用间接?Dot-ELISA?方法检测志贺氏菌的检出限可达106CFU/ml。E?L?ISA?法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，适用于志贺氏菌的快速检测，但ELISA?方法影响因素多，假阳性率高且不易确定，还需要其他方法辅助检测。? 2.2.2?SPA协同凝集法? 金黄色葡萄球菌A?蛋白(Staphylococcal?protein?A，SPA)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，具有同人和多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合的能力。SPA?协同凝集法是用已知标准血清吸附到含A?蛋白的金黄色葡萄球菌表面，使之成为吸附抗体的载体，再以此去诊断相应未知抗原产生的肉眼可见的凝集颗粒。用含A?蛋白丰富的金黄色葡萄球菌菌体与志贺氏菌抗血清在一定条件下混合致敏，让抗体结合到金黄色葡萄球菌细胞壁的A?蛋白上制成SPA?诊断试剂，样品经增菌后即可用SPA?诊断试剂来检验。SPA?协同凝集法在?24～48h?内即可得到检测结果，且检出率高，可作为一种快速灵敏的检验方法。由于SPA?能结合大量抗体，大大提高了灵敏性，缩短了检验周期。? 2.3?分子生物学方法? 以分子生物学为基础建立的众多检测技术以其敏感、快速、高特异等特点成为生物技术革命的新产物,已经应用于食源性致病菌的检测。检测志贺氏菌的分子生物学技术主要包括：聚合酶链反应、脉冲场凝胶电泳、基因芯片和探针技术等。? 2.3.1?聚合酶链式反应? 志贺氏菌的传统检测方法耗时长，操作繁琐，已不能满足食品安全控制的需要。分子生物学尤其是?PCR技术的发展给志贺氏菌的快速检测提供了广阔的空间。在此主要介绍用于志贺氏菌检测的常规?PCR?检测方法，实时荧光?PCR?检测方法和多重?PCR?检测方法。?2.3.1.1?常规PCR检测? 聚合酶链式反应(polymerase?chain?reaction，PCR)是依据DNA?模板模仿体内的复制过程，在体外适合的条件下，以单链DNA?为模板，以人工设计与合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA?聚合酶沿5′→?3′方向掺入单核苷酸来特异性地扩增?DNA?片段的技术。通过对已知序列DNA?进行扩增，以侵袭性质粒抗原(invasive?plasmid)作为检测志贺氏菌的目的基因来设计引物，建立?PCR?检测方法。PCR?检测志贺氏菌的目的基因有ipaB.ipaC、ipaD?和ipaH，还包括set1A.set1B、ial和virA等片段。现将有关文献中报道的用于检测志贺氏菌的引物序列总结于表2－1。? ??????????????????????????????表2－1检测志贺氏菌的引物序列???? ? 2.3.1.2?基于PCR?方法的复合技术? P