【2017年整理】病理组织学常用制备技术.docxVIP

一、组织的固定 （一）固定的概念 应用各种方法使病理标本尽量保持其离体前状态的过程称为固定（fixation）。 病 理标本（样本）离体后，由于微环境的变化将发生自溶和（或）腐败，使其结构破坏。固定的目的和机制是：①使蛋白质凝固，终止或减少分解酶的作用，防止自 溶，保存组织、细胞的离体前结构状态，包括保存组织或细胞的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。②保存组织、细胞内的蛋白质、脂肪、糖原、某些维生素及病 理性蓄积物，维持病变的特异性特征。③使上述物质转为不溶解状态，防止和尽量减少制片过程中人为的溶解和丢失。④起助染作用。 固定方法有：①物理学方法，如低温冷冻，干冰（dry ice，即固态无水碳酸）冰冻真空脱水，石蜡渗入法。②化学方法，采用各种化学溶液作固定液，使组织细胞进入固定状态。这是国内最常用的方法。 固定应在标本离体后尽快进行，小标本可在取材后直接放入固定液内，大标本应在手术结束前或结束后迅速放入固定液内。 固定液与标本的比例不得少于标本体积得5倍。有特殊要求者应事先选定相应得固定液，如欲查糖原，应选择无水乙醇作固定液等。 固定得时间应适当，微小标本（如胃粘膜等）2～4h即可，大标本应置放12～24h，但亦不要过久，以免影响抗原性，造成免疫组化操作中得困难。 （二）常用固定液及其配制 固定液分单纯固定液和混合固定液。 1.甲醛（formaldehyde） 是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。 10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。 经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。 2.乙醇 无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。 3.中性甲醛液（混合固定液） 甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。 4.AF液（混合固定液） 95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。 此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。 以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。 二、常规石蜡切片操作 （一）组织洗涤 经过固定的组织一般都要洗涤（washing），其目的是清除组织内外残留的固定剂，以免影响脱水等后续过程；防止有些固定剂在组织中发生沉淀或结晶而影响观察。洗涤时最好是从容器的底部入水，再从容器上面缓慢流出，这样2h即可，若为陈旧标本则需24h。 （二）组织脱水 1.概念 为保证石蜡有可能进入组织内部，采用适当方法，将已固定和水洗过的组织中的水分彻底驱除的过程称为脱水（dehydration）。脱水剂必须是与水在任何比例均能混合的液体。最常用的脱水剂为乙醇，其它尚有正丁醇和二氧已环以及丙酮等。 2.浓度与时间 脱水用的乙醇浓度一般从70％~75％开始，然后依次80％→95％→100％，即由低浓度逐步到高浓度。脱水的时间与组织大小、厚薄有很大关系、组织厚 大，脱水时间要长些；而小薄的组织脱水时间相对的可以短些。组织脱水时间在低浓度乙醇中可以长些（如70％~80％），而在高浓度乙醇中要短些，这是因为 高浓度的乙醇渗透力不强，延长脱水时间无益，相反高浓度乙易使组织收缩、变脆，致使以后切片和观察困难。 （三）组织透明 采用既能与脱水剂 （如乙醇）混合，并使之被提去（dealcoholisation），又能作为石蜡溶媒的诱导剂，使石蜡真正渗入组织中的过程称为媒介 （intermediary）。由于常用的透明剂（如二甲苯）作用之后，其折射指数与组织蛋白折射指数接近，组织显示出半透明状态，因此，通常又称此过程 为透明（clearing）。但并非所有媒介过程均使组织透明。 常用的透明剂为二甲苯，它易使组织收缩、变脆，故透明时间不宜长，一般1..5~2h，二节（即换2次，下同），最好是肉眼观察，见组织呈棕黄*色或暗红色透明状（象琥珀样）即可。 （四）组织浸蜡 组织经媒介（透明）处理后，置入熔化的石蜡内浸渍，使石蜡分子浸透入组织中的过程称浸蜡或石蜡渗透（infiltrating）。渗透的过程也可用火棉胶代替石蜡，称为浸胶。但其透明过程应作相应更动。 浸蜡一般分2~3节，总共4~24h，浸蜡时间过短，蜡没有完全渗入组织中，组织