活性氧胁迫促进枯草芽孢杆菌WSHDZ-01 过量合成过氧化氢酶[精选].pptVIP

生物工程学报 2009, May 25; 25(5): 786-792 姚丹丹, 刘立明, 李江华, 华兆哲, 堵国成, 陈坚 OUTLINE 摘要 简介 研究材料与方法 结果与讨论 结论 摘 要: 研究了乙醇和H2O2 胁迫对芽孢杆菌(Bacillus sp.) WSHDZ-01 过量合成过氧化氢酶(Catalase, 简称CAT)的影响。在Bacillus sp.WSHDZ-01 培养体系中添加2.0%(V/V)乙醇, 胞内过氧化氢酶酶活达到11151U/mL, 是对照组的2.5倍。而在培养体系中添加0.3%(V/V)H2O2, 则使胞内过氧化氢酶不断分泌到胞外,胞外酶占总酶活比率增加至27%。基于上述发现,分别以不添加胁迫物(a)、乙醇胁迫(b)、H2O2 胁迫(c)为对照,在培养体系中维持持续的乙醇和H2O2 胁迫,结果表明:1)胞外酶比例达82.5%;2)发酵周期缩短为42 h,比对照a延长了6 h,比对照b和c分别缩短了8h和6h;3)生产强度达到470 U/(mL·h), 比对照a提高了18.6%,为过氧化氢酶工业化生产奠定了基础。 过氧化氢酶简介 过氧化氢酶(Catalase, 简称CAT)通过催化H2O2分解为H2O 与O2 而作为一种酶类清除剂广泛应用于纺织、食品、医药、临床等行业, 具有反应条件温和、催化效率高等优点。前期研究中通过营养和环境条件优化, 显著提高了Bacillus sp. WSHDZ-01发酵生产过氧化氢酶的酶活, 但难以进一步提高酶活。出现这一现象的核心原因在于没有深入理解生物体系过量积累过氧化氢酶的机理。过氧化氢酶在生物体内以铁卟啉为辅基, 催化H2O2 分解而清除体内的H2O2, 使细胞免受活性氧的毒害, 是生物防御体系的关键酶之一。基于此, 作者考虑: 能否将细胞置于活性氧胁迫的非正常生长环境下, 促使微生物细胞为了抵御这一胁迫而不断过量合成过氧化氢酶？常见的思路是在培养体系中添加乙醇和H2O2 。Bacillus sp.WSHDZ-01 能利用乙醇为唯一碳源微弱生长, 并进而在体内生成活性氧[3](图1),基于这一思路, 作者研究了乙醇(内源)和H2O2 胁迫(外源)对Bacillus sp. WSHDZ-01 过量合成胞内和胞外酶的影响, 并证实了同时采用内外源氧化胁迫的策略能有效地促进过氧化氢酶生产。 研究材料与方法 结果与讨论 当乙醇浓度为2.0% (V/V),与未添加的对照组比较, 过氧化氢酶总酶和胞内酶活分别提高了126%和150%. Bacillus sp.WSHDZ-01 能利用乙醇为唯一碳源微弱生长。然而, 图2 表明, 细胞浓度随着乙醇浓度的增加而逐渐降低, 当乙醇浓度为1.0%和2.0%时, 细胞浓度分别下降13%和16.2%。这表明乙醇的添加对菌体生长有一定 抑制作用。 1.乙醇促进胞内过氧化氢酶合成 进一步分析添加2.0%乙醇后每隔20 min 胞内酶活和总酶活的变化情况(图3)发现, 随着乙醇胁迫时间延长, 胞内酶活占总酶活的比例不断增加。乙醇促进Bacillus sp.WSHDZ-01 过量合成过氧化氢酶的可能机制在于:1) 作为碳源促进细胞生长; 2) 在细胞内生成大量活性氧, 迫使细胞过量合成过氧化氢酶以清除活性氧所引起的毒性。 1.乙醇促进胞内过氧化氢酶合成 2 乙醇持续胁迫加强CAT 的合成 图4 乙醇消耗速率(A)与添加时间(B)对过氧化氢酶发酵的影响 图4B), 发现与对照组(未添加) 比较, 过氧化氢酶总酶活分别提高了54%、37%和16%;这一结果表明, 持续的乙醇胁迫能更有效地提高过氧化氢酶的合成效率。基于多次分批添加乙醇能明显提高CAT 产量以及不同阶段乙醇的消耗速率(图4A),作者分阶段恒速流加乙醇以使Bacillus sp.WSHDZ-01 处于持续活性氧胁迫下, 结果如图5A、5B 所示, 过氧化氢酶总 酶活(28 990 U/mL)和胞内酶活(9691 U/mL)均达到最大值。 2. H2O2 促进胞外过氧化氢酶合成 考虑到微生物细胞合成CAT 的生理机制是抵御活性氧的伤害, 为了进一步促进CAT 的生成,将对数生长后期(12 h)的Bacillus sp.WSHDZ-01 细胞置于不同浓度H2O2(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%(V/V))胁迫下, 以研究培养体系中H2O2 胁迫对细胞生长和过氧化氢酶合成的影响, 结果如图6 所示。 由上图可知过氧化氢酶酶活和单位细胞产酶的能力均随着H2O2 胁迫浓度(0~0.3%, V/V)的增加而不断提高,而细胞浓度则呈下降趋势(图6A)。添加0.3%(V/V)H2O2使总酶活提高到9254 U/mL (图6A), 较对照组(未添加H2O2)提高了43.5%。继续增加