【2017年整理】单分子测序技术的产生及前景.docxVIP

单分子测序技术的产生和前景摘要：目的：简要介绍基因测序技术的发展，重点介绍了第三代测序技术即单分子测序技术的类型和原理，并且对单分子测序技术的前景进行展望。方法：以国内外现有论文为基础进行整理归纳结果：单分子测序是在第一、二代测序技术的基础上发展起来的新技术，分为合成测序和直接测序两种方法。单分子测序技术速度快，测序通量大，可应用于多个生物学，医学领域。关键词：基因测序技术 单分子测序技术 基因芯片技术基因测序分为DNA测序和RNA测序。DNA测序，是指特定分析DNA的有关序列，即鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶 四种碱基的排列方式。 而RNA测序，通常是通过反转录为DNA而进行DNA测序从而推出RNA对应的碱基排列顺序。基因测序的意义不仅在于完成人类基因组计划的技术难关，更在于其广泛的应用领域，如基因诊断，生物技术，法医生物学，生物信息学，生物系统学等等。基因测序技术最早出现于20世纪50年代，即Whitfeld等在1945年使用化学降解的办法测定多聚核苷酸序列。而后，在1977年，Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。Sanger测序法使用的变合成边测序的思想也被用于第二代和第三代测序技术。此后的三十多年中陆续发展产生了第二代测序技术。随着1986年人类基因组计划的首次提出，基因测序作为人类基因组计划的技术基础也越来越被重视。并将基因测序技术的理论逐渐付诸实践。而最近的单分子测序技术被认为是第三代测序技术。经典的基因测序方法多采用Sanger测序法的边合成边测序的思想，并且是同时测定多个位点的一种碱基，这造成了较大的误差和后续工作量。而最近新出现的单分子测序，通过对单个分子碱基种类的测定，极大地减少了误差，提高了准确率和测序通量。特别的是，其中的纳米单分子测序仪突破了边合成边测序的传统思想，提高了速度并且采用相关仪器可以极大的降低成本，有很好的发展前景。第一代测序技术的产生及发展 第一代测序技术指的是以Gilbert法和Sanger法为代表，包括一些其他的测序方法，如焦磷酸测序法、连接酶测序法、杂交测序法等测序方法。第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组及单细胞模式生物如啤酒酵母，再到一些小型基因组生物如水稻、玉米、秀丽新小杆线虫，再到人类基因组草图等大量的测序工作。为第二代，第三代测序技术的产生和发展奠定了基础。也是目前为止测序工作最主要采取的技术。早在1954年，Whitfeld等就提出了利用磷酸单酯酶的脱磷酸化作用以及高碘酸盐的氧化作用测定多聚核糖核苷酸链的化学降解法，这种方法从DNA链的末端逐一分解出单个脱氧核苷酸进行测序，操作繁琐，错误率大，因此没有被广泛应用。在1977年，Gilbert等提出了化学降解法，Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸（ddNTP）末端终止测序法。Sanger测序法采用边合成边测序的思想，利用双脱氧核苷酸的2′和3′都不含羟基的特性，即在DNA合成反应中不能于其他核苷酸分子的磷酸基团形成磷酸二酯键，该ddNTP分子结合到DNA链上时，新链的合成即被终止。在测序时，向4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种双脱氧核苷酸，然后通过凝胶电泳和放射自显影，根据电泳带的位置来确定待测分子的DNA序列。和Gilbert测序法不同，Sanger测序法利用了生物反应特性即DNA复制特性，而不是纯化学方法。因而Sanger法更为高效，应用也更为广泛，被认为是一种经典的测序技术。其边合成边测序的思想被许多第二代测序方法所采用。此后，在Sanger法的基础上，标记和读取序列的方法出现了改进。如以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。第二代测序技术经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术最显著的特点是先将待测序列打断成小分子序列，再用PCR技术对小分子序列进行扩增，其中克隆的扩增通过以下几种方式之一进行, 如桥PCR、微乳滴 PCR或原位成簇。然后用相应载体吸附小分子序列，利用Sanger法的边合成边测序思想完成测序工作。因而第二代测序技术又被称为循环阵列测序技术，, 这些方法所采用的技术与生物化学相当多样, 但是都采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术——阵列上的 DNA 样本可以被同时并行分析. 此外, 测序是利用 DNA 聚合酶或连接酶以及引物对模板进行一系列的延伸, 通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号实现的。第二代测序技术与第一代Sanger测序法的原理相同，即基于边合成边测序的思想，在测