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丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)论文：MAPK在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复过程中的生理功能 【中文摘要】MAPK是一类广泛存在于真核细胞中的Ser/Thr蛋白激酶,参与调节各种生理活动。该酶家族分为三类,胞外信号调节酶(the extracellular signal regulated kinase ,ERK), c-jun氨基末端激酶(the c-Jun NH terminal kinase, JNK)和p38 MAPK。其中ERK又包含多种蛋白家族成员,研究最多的是ERK1和ERK2,通常MAPK就是指ERK1和ERK2。近期研究表明,MAPK信号通路在卵母细胞减数分裂过程中发挥重要作用。本文首先以不同激素对斑马鱼卵母细胞进行成熟诱导培养,研究激素对卵母细胞成熟的促进作用,选择合适卵母细胞体外培养体系;其次用17α,20β双羟孕酮(17α,20β-DHP)和FSH诱发以GVBD(germinal vesicle breakdown,GVBD)为标志的卵母细胞成熟,利用Western Blot检测MAPK(p-MAPK)在斑马鱼卵母细胞发生GVBD中的表达量,研究MAPK对斑马鱼卵母细胞的成熟调节作用;最后在改进石蜡切片的基础上,通过免疫组化技术,检测MAPK在卵母细胞GVBD产生时的时空分布和位移,并探讨了这个时空分布的生理意义。第一部分,建立了斑马鱼卵母细胞体外培养体系。比较了17α,20β-DHP和FSH体外诱发斑马鱼卵母细胞成熟作用。结果表明:①1U/mL FSH对斑马鱼卵母细胞GVBD促进效果最明显,与对照组相比卵母细胞GVBD率在FSH作用2 h、4 h、6 h、8 h后分别提高了11.98%、16.67%、6.31%、14.25%;添加10μg/mLU0126后,其GVBD率在2h、4h、6h、8h分别降低了26.11%、29.2%、23.12%、28.73%。②5 ng/mL l7α,20β-DHP的对斑马鱼卵母细胞GVBD促进效果最明显,与对照组相比卵母细胞GVBD率在l7α,20β-DHP作用2 h、4 h、6 h、8 h后分别提高了17.84%、44.67%、27.62%、23.03%;添加10μg/mLU0126后,其GVBD率在2h、4h、6h、8h分别降低了15.19%、46.82%、32.38%、27.4%。结果表明,FSH和l7α,20β-DHP对卵母细胞都有明显的的促进作用,其中l7α,20β-DHP促进作用显著好于FSH。第二部分,MAPK在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用。在第一部分实验的基础上,用5 ng/mL l7α,20β-DHP诱导卵母细胞成熟,通过Western Bolt技术检测MAPK的表达。结果表明:在GVBD之前,MAPK被激活,MAPK活性越大,GVBD%越高。对照组中4h的时候才可以检测到MAPK活性,而且从4h-8h之间MAPK活性变化不大,GVBD%增长缓慢。实验组中卵母细胞在培养2 h后可以检测到激活的MAPK (pMAPK),随着时间推移pMAPK表达逐渐增多,6 h时pMAPK表达量达到最大。随着MAPK激活,卵母细胞发生GVBD,完成第一次减数分裂。最后添加10μg/mL U0126,抑制MAPK表达后,卵母细胞GVBD率明显降低。结果显示MAPK在卵母细胞的第一次减数分裂恢复中有重要促进作用。第三部分,斑马鱼卵母细胞GVBD过程中,MAPK时空分布。首先对卵母细胞石蜡切片制作过程技术了优化。对脱水、透明环节的时间进行了摸索、改进。制作的卵巢组织石蜡切片不易碎,镜下观察组织结构清晰,能清楚地观察到斑马鱼卵巢的I期、II期、III期、IV期、V卵母细胞,卵巢中的卵黄颗粒等细胞卵泡结构,能够满足切片要求和后续实验要求。然后通过免疫组化技术检测了在不同时期激活的MAPK在卵母细胞中的分布,结果表明:I期MAPK没有被激活;在II期时,活化的MAPK开始在细胞质中表达;在III、IV的时候,活化的MAPK表达量增多;卵母细胞在V期时已经发生GVBD,此时在细胞质和核区均可观察到激活的MAPK。实验结果表明FSH激活l7α,20β-DHP的表达,进而磷酸化MAPK,使细胞质中的MAPK激活,然后活性MAPK从细胞质向细胞核转移,从而其他蛋白的活性,促进斑马鱼卵母细胞发生GVBD和调节其他一些生理过程。所以MAPK在其第一次减数分裂过程中起到重要的作用。 【英文摘要】Mitogen Activated Protein kinase(MAPK) is a kind of Ser/Thr protein kinases that in