[显影剂说明.docVIP

重要提醒： SuperSignal West Pico化学发光底物一抗：1:1000-1:5000二抗：1:20000-1:100000Ml 说明 Thermo Scientific SuperSignal West Pico化学发光底物是检测辣根过氧化物酶标记的抗体的一种高度敏感性增强的溶液。这种溶液能够强烈的检测到皮微克的抗原总量。信号的灵敏性、强度、持续时间允许用摄影或其他的成像方法来检测辣根过氧化物酶。免疫印记可以重复的曝光以获取最佳的结果，或者重新洗膜，再敷上另一种抗体，检测另一种蛋白。 重要产物的信息 为了最好的结果，优化Western Blot中所有的组成部分是必不可少的，包括样品总量、一抗及二抗的浓度、膜的选择、封闭液。因为溶液是极端敏感的，所以SuperSignalWest Pico溶液比其他市场上可以买得的液体来说，需要更少的样品总量、一抗及二抗，通常减少10-20倍。同时应用Thermo Scientific SuperSignal Western Blot增强剂可以使该溶液敏感性增强，背景减少，抗体特异性提高。 抗体浓度要比用沉淀比色合系统Thermo Scientific Surfact-Amps20(产品号28320)，这是一种放于安培瓶中的纯化的清洁剂，并确保里面有少量的过氧化物和其他的污染物。 不要用叠氮化钠作为缓冲液的防腐剂，叠氮化钠是辣根过氧化物酶的抑制剂，干扰这个系统。 不要用手直接接触膜。要戴手套或用干净的镊子。 所有的设备必须是干净的，没有异物。金属器材（剪刀等）没有肉眼可见的灰尘，灰尘可以导致黑点或者高背景。 底物工作液室温条件下可稳定24h，暴露于阳光下或者其他强烈的光下可损坏工作液。为了最佳的结果，工作液置于琥珀色瓶子里并避免任何强光长时间的照射。实验室灯光的短时间照射是不损害工作液的。 我们提供各种转移蛋白的膜、封闭液、一抗、酶标记的二抗、缓冲液、洗涤剂。对于我们的产品或者订购信息感兴趣的话，可以访问我们的网页。 程序总结： 注意：抗原抗体浓度达到最优化，使用推荐的抗体稀释比例从而可以一贯性地获得阳性结果，推荐的抗体比例可以参考Additional Materials Required部分。 将1mg/mL的一抗稀释至0.2-1.0μg/mL 或者 1:1000-1:5000稀释； 将1mg/mL的二抗稀释至10-50ng/mL或者1:20,000-1:100,000稀释； 将两种基础成分（即显影剂的A液与B液）按照1:1的比例配成工作液； 注意：工作液暴露于太阳光或者其他任何强光下都会受到损害，因此将工作液盛放于琥珀色瓶子中并且避免长时间暴露于强光下，短期放置于实验室标准光下不会损伤工作液。 将印迹膜放置于SuperSignal West Substrate工作液中孵育5分钟； 排干多余的试剂，使用干净的塑料薄膜覆盖印迹膜； 在X-光下曝光 其他所需材料： 完整的Western Blot膜：用适当的方法用电泳分离蛋白质，并把蛋白质转移至硝酸纤维膜上。其他类型的膜也可以应用；但是，最佳的膜优先。 稀释缓冲液：用TBS（产品号28376）或者PBS（产品号28374）。二者择其一，稀释SuperSignal Western Blot增强剂里的一抗，以进一步增强敏感性和特异性，降低背景。 洗涤缓冲液：在1000mL稀释缓冲液中加入10%Tween-20 5mL。（Tween-20最终的浓度是0.05%） 封闭液：100mL封闭液中加入10%Tween-20 0.5mL。用与稀释溶液相同的基底成分配制封闭液。 一抗：选择对靶蛋白有特异性的抗体。用稀释缓冲液稀释1mg/mL抗体的原液。用这种封闭液去配这种抗体原液的所有工作稀释液。准备抗体稀释至1：1000～1：5000或者0.2-1ug/Ml。最佳稀释浓度以特异性一抗和膜上抗原的总量而定 。 辣根过氧化物酶标记的二抗：选择针对一抗的辣根过氧化物酶标记。把1mg/mL抗体稀释在缓冲液中。用这种缓冲液去配这种抗体原液的所有工作稀释液。稀释浓度为1：20000～1：100000或者10-50ng/mL。最佳稀释浓度与辣根过氧化物酶结合和膜上抗原的总量而定。 放膜的暗盒、显影和定影：曝光机。 摇床：孵育时，摇晃膜。 Western Blot的详细步骤 转膜之后，室温条件下，把膜放在封闭液中20-60分钟，以阻止非特异性蛋白，要置于摇床上摇晃。注意：用前文提到的其他所需材料中建议的抗体稀释浓度是非常重要的。 倒出封闭液，敷上所需的一抗。置于摇床上，孵育1h。如果需要的话，一抗孵育也可在2-8℃过夜。 用洗涤缓冲液洗膜，置于摇床上，4-6次，每次大于等于5min。增加清洗缓冲液的量或洗的次数能够降低背景。注意：在孵育之前洗一下膜的话，将提高冲洗