蛋白质分析剖析.ppt

PCR 引物设计 引物设计的原则 ?首先引物要跟模板紧密结合； 其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在； 最后引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。 引物设计需要考虑的因素 围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如： 引物长度（primer length）， 产物长度（product length）， 序列Tm值 (melting temperature)， ΔG值(internal stability)， 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）， 错误引发位点（false priming site）， 引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。 引物设计要点 一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp，过长或过短都不合适。 引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。 引物设计要点 ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标，一般情况下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而3’端ΔG值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。 引物设计要点 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。 关于引物的自动搜索和评价分析 推荐使用自动搜索软件： Primer Premier 5.0 推荐使用引物评价软件： Oligo 5/6 OLIGO 5.0 PCR 引物设计 （二） 分析蛋白质的二级结构 二级结构：主要是氢键维持的结构 ?－螺旋（?-helix） ?－折叠（?-sheet） 弯（turn） 2. 分析糖链连接点 糖链连接方式 O－连接：丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸的羟基 N－连接：天门冬酰氨的酰氨基 常用观看蛋白三级结构的软件 RasMol / WPDB Cn3D /Structure/CN3D/cn3d.shtml 四） 分析膜蛋白质 膜蛋白种类 膜镶嵌蛋白质 膜附着蛋白质 预测蛋白质的跨膜区 ExPASy 主页选择Post-translational modification and topology prediction 在“Topology prediction”栏目选择“SOSUI”分析工具 在SOSUI主页选择分析“SOSUI”分析软件 在SOSUI：Submit a protein sequence网页粘贴序列 分析结果 其它分析软件 DAS：分析原核生物蛋白质的跨膜结构 Tmpred：分析蛋白质的跨膜结构和在膜上的方向 （五）分析蛋白质的翻译后修饰 分析信号肽及其剪切位点 信号肽序列的特征 20－35 个氨基酸 富含疏水氨基酸的片段 至少有一个带正电荷的氨基酸 ExPASy 主页选择 Post-translational modification and topology prediction 在“Post-translational modification”栏目选择“SignalIP”分析软件 在SignalIP网页选择物种参照和分析方法，粘贴序列 分析结果 * 第四讲 多序列对位排列分析 2008-3-17 * 主要应用于分析基因或蛋白质的进化 通过分析多个基因或蛋白质序列之间的同源性确定它们在进化上的关系 分析基因家族中新成员的翻译起始位点和内含子（预测的氨基酸序列的对位排列分析） 分析基因或蛋白质的功能 1. 多序列对位排列分析 （multiple sequence alignment)