血培养VS分子生物学剖析.ppt

* 血培养 VS 分子生物学 血流感染快速分子诊断 分子诊断不受抗菌药物使用的影响 血培养阳性后分子诊断 直接使用血标本进行分子诊断 快速但不能提供药敏结果 血培养阳性瓶分子鉴定 Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209 阳性血培养－基于PCR的检测 PCR特异性检测 病原特异性PCR 特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA, 肠球菌van 细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数 广谱检测：PCR扩增特定靶位 多态性分析 测序 后续基因检测 种特异性real-time PCR Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis.?2011, 24(2):137 qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌 * Target：ecfX gene 血培养系统：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均显示G-b 对照方法：氧化酶，API 20E DNA提取：0.5ml肉汤，离心后加裂解液，水煮法 定量PCR： 扩增：Oligonucleotide primers 基因特异性检测：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragment Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21 qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌 * 33瓶pae，敏感性和特异性均为100% 1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)≤kpn (108CFU/ml)，PCR(-) 检测限：将ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21 阳性血培养－基于PCR的检测 最常见病原体多重PCR 电泳谱、ELISA杂交、多重Real-time PCR Hyplex BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成 Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：多重real-time PCR+微阵列分析，检测多种病原及mecA，3h完成 多重Real-time PCR Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. 血培养阳性－多重real-time PCR NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013 血培养阳性－多重real-time PCR NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013 血培养阳性－PNA FISH核酸荧光原位杂交 * 血培养阳性肉汤　　革兰染色　　PNA FISH 革兰阴性菌： 商品化试剂盒eco/kpn/pae Efa/其它肠球 Sau/scn Cal/cgl/其它念珠菌 报道Salmonella spp. 90min PNA FISH完成 Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301 J Clin Microbiol. 2009; 47: 247 MALDI-TOF MS 基质辅助激光解析电离（MALDI） 原理：将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样，当用激光照射结晶时，基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。 基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子 基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度；不同类型的分析物选择不同的基质 MALDI-TOF MS 飞行时间（TOF） 原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时，质量较轻的离子飞行速度快，早到达检测器；质量较重的离子飞行速度慢，晚到达检测器。因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根（m/z）成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出相应离子的分子量。 MALDI-TOF MS操作步骤 MALDI-TOF MS快速鉴定阳性血培养 * 使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定 快速：20分钟(从报警到鉴定出结果） MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD): 正确鉴定：193/213阴性菌（包括厌氧菌）(90.61%)，284/319阳性菌(89.02%) 80.9%复数菌正确鉴定出一种，7株缓症链球菌鉴定为spn MALDI-TOF M